由中国科学院微生物研究所完成，测序结果用Blast软件Genbank中的16S rDNA序列进行同源性比较。
[0029]LY05的16SrDNA序列如SEQIDNO. 1所示：该菌株的16SrDNA序列已经提交到 GenBank数据库（GenBank登录号：KT207940)，发现该序列与cere化？JN052922. 1 等菌株的基因序列同源性达99%。
[0030] 3)生长特性分析 进行了菌株最适溫度和最适抑生长实验。采用无机盐培养基，分别在20°C、25°C、 30°C、35°C和40°C培养、观察、记录菌株的溫度适应性，每个处理3次重复。调整酸度分别为 pH4、P册、P册、pH7、P册、pH9,每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适抑。结 果表明，所述降解菌LY05的最适生长溫度为30-35°C，最适生长抑为7。
[0031] 鉴于上述菌株LY05的形态、生理生化特性和16SrDNA序列分析结果，将降解菌 LY05鉴定为蜡状芽抱杆菌cereus)。所述蜡状芽抱杆菌cereus) LY05于2015年6月19日保存于中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，地址为中国武汉，武汉 大学，保藏号为CCTCCN0:M2015397。
[003引本发明的实施例2 :仲下灵农药残留降解菌剂的制备： 采用高效降解仲下灵的蜡状芽抱杆菌LY05的菌株生产降解仲下灵制剂的方法，包括 如下步骤： 1) 将蜡状芽抱杆菌LY05的菌株于无机盐培养基中，30~35°C，150~200巧m下振荡 培养至对数生长期，获得菌种. 2) 将上述菌种按无机盐培养基的体积比的10%的接种量接种入种子瓶，30~35°C， 150~200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液； 3)将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30~35°C、 150~200rpm下发酵培养45-5化，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.OX10?C化/mU将发 酵液直接稀释为液体菌剂，液体菌剂中的菌数为2. 0X108C化/mL。
[0033] 其中，步骤2)中所述的发酵培养基与步骤3)中所述的发酵培养基相同，其组成按 质量百分比比计算，包括酵母膏0. 5%，蛋白腺1%，葡萄糖0. 5%，化C1 1%，，其余为水，pH7。
[0034] 本发明的实施例3 :降解菌LY05对仲下灵的降解效能： 在无机盐培养基（同实施例1)中加入仲下灵，使其终浓度为50. 0mg/L;接种浓度为 2.0Xl〇scfu/mL的菌剂，并设不接菌的培养基为对照，30°C(200rpm)黑暗培养0~7山 定期取样。应用上述HPLC法测定仲下灵的残留量并计算降解率。降解率=(对照样品残留 量-处理样品残留量）/对照样品残留量X100%。结果见图2所示。结果表明，降解菌LGY06 在短时间内可有效降解仲下灵，3d内对仲下灵的降解率分别达到69.88%，5d内对仲下灵 的降解率分别达到85. 84%，7d内对仲下灵的降解率分别达到89. 94%，具有较好的生物降 解效果。在不加菌的对照中，仲下灵的降解率均小于6%。试验结果表明，降解菌LGY06对 50. 0mg/L的仲下灵具有很好的降解能力。运一结果表明，本发明所提供的降解菌LGY06可 高效降解締仲下灵，在修复仲下灵污染的水体和±壤方面具有广阔的应用前景。
[0035] 实施例：4 :降解菌剂对±壤中仲下灵农药残留的降解效果： 取蔬菜地±壤，自然风干，过20目筛，进行灭菌处理。灭菌及未灭菌的±壤按50mg/ 4邑干±的量加入仲下灵，揽拌均匀，过夜。花盆消毒后，每盆装入1000g±样，未灭菌±壤 也同样装盆，作为模拟试验污染上壤。然后按3. 0X109个细胞/g干±的量加入降解菌剂， 保持±壤的含水量在40%左右，溫室培养。分别于0、1、5、10、15、和20d取±层同等深度的 样品，进行测定。W不接菌的±壤作为对照。每个处理=个重复。降解率=(对照样品残留 量-样品样品残留量)/对照样品残留量X100%。试验期间每3d称量1次，加水补足水分 含量。
[0036] 降解菌剂对±壤中仲下灵的降解率如图3所示。由图可知，无论是灭菌±、还是自 然±壤，降解菌剂对仲下灵的降解均有显著的促进作用。施用降解菌剂后自然±壤中第5 天降解率就达到567. 23%，第10天达到80. 40%，第15天达到92. 63%，W后降解速率减慢，因 为±壤中的仲下灵已经很低，降解菌与农药之间的接触机会下降。整个降解过程中，仲下灵 在自然±中的降解率高于灭菌±中的降解率，因为自然±中存在的微生物起到了加速降解 的作用；而不接降解菌剂的对照±壤中，仲下灵的降解效率较低，20天后的降解率低于为 20.0%〇
[0037] 上述实施例中所用的培养基如下： 无机盐培养基：皿2口〇40. 4g，K2HPO40. 4g，畑典1 1g，MgClz0. 1g，Na2S〇41. 425 邑，FeS〇4.7H2〇 0.025g，微量元素液10血，加蒸馈水定容至1100血，pH7.0,高压蒸汽灭 菌（12rC，20min)。其中微量元素液组成如下：ZnS〇4.7H2〇 1. 1g，M拆〇4.&00. 58邑， (NH4)sM〇7〇24 ? 4&0 0. 18g，CoS〇4. 7&0 0. 024g，CuS〇4. 5&0 0. 077g，H3BO30. 029 邑， NaN〇3? 4&0 0. 074g，蒸馈水 1L。
[0038] 分离培养基：无机盐培养基中按实验设计要求添加不同浓度仲下灵唯一碳源，pH 7.0 (固体培养基添加20g琼脂)。
[0039] 牛肉膏蛋白腺培养基：牛肉膏3.0g，化Cl5.0g，蛋白腺10.0g，蒸馈水1000 血，琼脂20.0g，抑7.0。
[0040]pH7. 0 缓冲溶液：取 57. 7ml1mol/L的胞2册〇4+42. 3ml1mol/L的化H2PO4， 加蒸馈水定容至1000mL。
[0041] W上培养基和缓冲溶液均在高压锅中12rc灭菌20~30分钟。
【主权项】
1. 一种高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05,其特征在于：其保藏号为CCTCC NO :M 2015397。2. 根据权利要求1所述的高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05,其特征在于：该菌株 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。3. -种如权利要求1所述的菌株在降解仲丁灵农药残留中的应用。4. 一种采用如权利要求1所述的菌株生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：包括 如下步骤： 1) 将蜡状芽孢杆菌LY05的菌株于无机盐培养基中，30~35°C，150~200 rpm下振荡 培养至对数生长期，获得菌种； 2) 将上述菌种按无机盐培养基的体积比的10%的接种量接种入种子瓶，30~35°C， 150~200 rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液； 3) 将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30~35°C、 150~200 rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3. 0 X IO9 cfu/mL，将发 酵液直接稀释5-20倍作为液体菌剂。5. 根据权利要求4所述的生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：在种子发酵罐和 生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0.40~0.60 m3/min，搅拌速度为150~ 200 r/min，温度30~35°C，种子罐的培养时间及生产发酵罐的培养时间均为45-50h，发酵 结束后菌体数量大于3. OX IO9 cfu/mL。6. 根据权利要求4所述的生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：步骤2)中所述的 发酵培养基与步骤3)中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比比计算，包括酵母膏 0. 5%，蛋白胨1%，葡萄糖0. 5%，NaCl 1%，其余为水，pH 7。7. 根据权利要求4所述的生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：步骤1)及步骤2) 中所述的无机盐培养基，KH2PO 4 0.4 g，K2HPO4 0.4 g，NH4Cl I g，MgCl2 0.1 g，Na2SO4 1.425 g，FeSO4 ? 7H20 0. 025 g，微量元素液10 mL，加蒸馏水定容至1100 mL，pH 7. 0,高压蒸汽 灭菌（121°C，20 min);其中微量元素液组成如下：ZnSO4 ? 7H20 I. I g，MgSO4 ? H2O 0? 58 g， (NH4)6Mo7O24 ? 4H20 0? 18 g，CoSO4 ? 7H20 0? 024 g，CuSO4 ? 5H20 0? 077 g，H3BO3 0? 029 g， NaNO3 ? 4H20 0? 074 g，蒸馏水 I L。
【专利摘要】本发明公开了一种高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05及其应用及使用方法，所述菌株已于2015年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是CCTCC？NO：M？2015397。所述菌株可在短时间内有效降解仲丁灵农药残留。以所述菌株制备得到的菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点。使用本菌剂可有效修复嘧菌酯仲丁灵污染的水体和土壤，解决农业生产中农药残留超标问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。CCTCC NO：M 201539720150619
【IPC分类】A62D101/04, A62D3/02, C12R1/085, C12N1/20, A62D101/28, C02F3/34, C02F101/38, B09C1/10
【公开号】CN105002124
【申请号】CN201510509384
【发明人】吴小毛, 龙友华, 尹显慧, 李明, 李荣玉, 张承
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年8月19日