一种地加瑞克的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药技术领域，特别涉及一种地加瑞克及地加瑞克醋酸盐的工业化制 备新工艺。
【背景技术】
[0002] 地加瑞克（Degarelix)由FerringPharmaceuticals公司开发（TradeName: Firmagon)，经美国FDA批准，于2008年12月24日在美国上市，用于治疗晚期前列腺癌。 地加瑞克是一种促性腺激素释放激素（GnRH)受体抑制剂类药物，可逆性地抑制垂体GnRH 受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放。地加瑞克通过抑制对前列腺癌持续生长 至关重要的睾酮来延缓前列腺癌的生长和恶化。以激素方法治疗前列腺癌来降低睾酮浓 度在初期时却造成睾酮浓度激增，此初始刺激该激素受体可暂时性地促进而非抑制肿瘤生 长，而地加瑞克则不会有这种现象。III期临床研究显示，地加瑞克降低睾酮浓度的效果至少 可与亮丙瑞林储库型控释注射剂（LupronD印ot)相媲美，而且降低睾酮浓度显效快。在治 疗的第3日，地加瑞克组96%达到去生殖腺的睾酮浓度，亮丙瑞林组效果为0%。第14日， 地加瑞克组99%达到去生殖腺的睾酮浓度，亮丙瑞林组为18%。在临床研究中，前列腺特 异抗原（PSA)浓度可作为监测的第2个疗效判断终点。使用地加瑞克2周后降低PSA64%， 1月后85%，3月后95%，在治疗的整个1年中始终抑制PSA。地加瑞克在临床研究中报道 的最常见的不良反应是：注射部位反应(疼痛，红肿和肿胀)，热潮红，体重增加，乏力和某些 肝酶浓度升高。
[0003] 地加瑞克是一种含有7个非天然氨基酸的线性十肽，肽序列为： Ac-D2Nal1-DPhe(4-C1) 2-D-3Pal3-Ser4-4Aph(L-Hor) 5-D-4Aph(Cbm) 6-Leu7-IIys8-Pro9- DAla10-NH2 化学结构为(结构I):
[0004]目前与地加瑞克合成相关的报道如下。
[0005] 专利CN102329373A的地加瑞克固相合成工艺包括如下步骤：以Fmoc保护的氨 基树脂为起始原料，按照固相合成的方法，用DIC/HOBt或DIC/HOAt为偶联剂进行接肽反 应，按照氨基酸序列依次连接保护氨基酸，其中5位苯丙胺酸残基侧链氨基先以Trt或 Alloc保护，去保护后偶联上氢化乳清酸，裂解得到粗肽，纯化后得到精肽(收率：40%，纯 度：99. 8%)。该方法由于在树脂上使用了TFA除去三苯甲基，会影响酸敏感的Boc等基团， 而使用四(三苯基膦)钯脱去Alloc，金属残留会影响重金属含量超标，会导致产品质量不合 格。
[0006] 专利CN103992392A的合成方法以Fmoc保护的氨基树脂为固相载体，HBTU/ HOBt/DIEA作为氨基酸偶联剂，用ivDde代替5位苯丙氨酸苯环4位氨基相连的乳清酸 片段，从C端到N端依次缩合反应连接10个保护的氨基酸，得到全保护肽树脂，然后脱掉 N端D-Nal的Fmoc保护基，用乙酸酐和吡啶乙酸化，脱掉ivDde替换上Hor。该方法采用 Fmoc-Aph(ivDde) -OH作为原料，此原料合成困难，工艺复杂，不适于工业化规模生产。
[0007] 专利CN102952174A的合成方法以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按照固相合 成的方法，用DIC/HOBt为偶联剂进行接肽反应，5位苯丙氨酸残基侧链氨基相连的氢化乳 清酸片段先以三苯甲基保护，使用TFA去保护后偶联上氢化乳清酸。该方法由于在树脂上 使用TFA除去三苯甲基，会影响酸敏感的Boc等基团，导致产品质量和收率不高，而且用的 生产原料较贵直接导致生产成本偏高。
[0008] 专利CN102428097B的地加瑞克合成方法以Fmoc保护的氨基树脂为起始原料，按 照固相合成的方法，用DIC/HOBt为偶联剂进行接肽反应，去保护选用哌啶和烷基取代哌 啶，可以防止Aph(L-Hor)的二氢尿嘧啶部分转化为乙内酰脲。该方法为传统的固相多肽合 成方法，缺乏足够的新颖性且生产成本高。
[0009] 专利CN103992378A发明公开了一种制备醋酸地加瑞克的技术，具体步骤为：首 先，在RinkAmideMBHA树脂上依次偶联10个氨基酸，DIC/6-Cl-HOBt作为氨基酸偶 联剂，其顺序为：Fmoc-D-Ala-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ilys(Boc)-OH,Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D_4Aph(Dde)-OH,Fmoc_4Aph(Teoc)-〇H，Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-D_3Pal-〇H， Fmoc-D-Phe(4C1) -OH,Fmoc-D-2Nal-0H;然后，脱去保护基Fmoc，醋酐封端后用2%水合肼 的DMF混合溶液脱去6位D-苯丙氨酸侧链氨基上的Dde，再通过三甲基硅基异氰酸酯DMF 溶液引入Cbm;使用四丁基氟化铵DMF混合溶液脱去5位苯丙氨酸侧链氨基上的Teoc，通过 偶联反应在该氨基上引入L-Hor。该方法需要在树脂载体上进行多肽合成修饰，操作工艺 复杂，不适于工业化规模生产。
[0010]在专利CN102329373A,CN103992392A,CN10295217A,CN102428097B发明公开的 地加瑞克合成方法中，6位氨基酸残基D-4-Aph(Cbm)在合成中采用侧链Cbm基团不保护的 Fmoc-D-4-Aph(Cbm)-OH或者侧链Cbm用t_Bu保护的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm) -0H.固相 合成中采用侧链不保护的Fmoc-D-4-Aph(Cbm) -0H，如果反应温度控制不当，在最后的乙酰 化封端过程中容易产生在侧链Cbm基因上的乙酰化副产物，该副产物难以分离纯化，将影 响工艺的效率和产品的质量。采用侧链用叔丁基保护的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm)，在完成 连结后需要去除保护基，而Aph(t-Bu-Cbm)侧链上叔丁基的脱除比较困难，需要在强酸水 溶液中加热条件下才能完全脱除，加大了产生消旋等杂质的可能性，影响产品质量。
[0011] 在专利CN103992378A发明公开的地加瑞克合成方法中，6位氨基酸残基 D-4-Aph(Cbm)在合成中采用Fmoc-D-4-Aph(Dde)-OH,最后醋酐封端后用2%水合肼的DMF 混合溶液脱去6位D-苯丙氨酸侧链氨基上的Dde，再通过三甲基硅基异氰酸酯DMF溶液引 入Cbm，以此来避免在醋酐封端过程中Cbm基团的乙酰化副产物。此工艺操作复杂，不适于 工业化规模生产。
[0012] 文献也报道了地加瑞克的Boc固相合成法（2001:880SYNTHLINE)和Boc液相合 成法（US6214798B1)。Boc固相合成法需要用HF进行裂解，对人体和环境都会造成很大危 害。Boc液相合成法所得地加瑞克纯度较低，只有96%-98%(J.Med.Chem.，2005，48， 4851)〇
[0013]目前报道的地加瑞克Fmoc固相合成法均采用了HOBt或类似物作为氨基酸偶联 剂，HOBt已经被归类为UN0508 1.3C类易爆化学品（J.Hazard.Mater.，2005，126， 1-7)，在运输和生产过程中有安全隐患。因此需要开发一种反应条件温和，安全有效的地加 瑞克固相合成方法。
【发明内容】
[0014] 针对现有技术的上述缺陷完成了本发明。本发明的目的是提供一种反应条件温 和，生产安全，操作简单，环境污染小，收率高，杂质少，适合规模化生产的地加瑞克固相合 成方法。
[0015] 在地加瑞克的合成工艺研究中我们发现，把Fmoc-D-4Aph(Cbm)_0H用于固相合成 中时，未保护的Cbm基团的弱亲核活性仍然可以构成杂质形成的威胁，如Cbm的乙酰化副产 物(结构2)及与活化氨基酸反应形成酰胺副产物(结构3)等。这些工艺杂质难以从产物中 除去，导致合成工艺杂质多，产品收率低：
[0016] 本发明的目的在于提供一种地加瑞克的制备方法，主要解决现有固相合成法 中有毒且难分离的地加瑞克杂质问题以及提高生产工艺的安全性。通过在合成中采用 Ac-D-2Nal-OH氨基酸和高效安全的偶联试剂很好地解决了这一问题。
[0017] 本发明的制备地加瑞克的固相合成方法包括以下步骤：a)以氨基树脂为固相载 体，通过固相合成法依次偶联地加瑞克序列中相对应的Fmoc保护氨基酸或Fmoc保护的地 加瑞克的肽片段，最后一个氨基酸采用Ac-D-2Nal-0H，制备得到侧链部分保护或全保护的 地加瑞克肽树脂；b)使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护。
[0018] 在a)步骤中可以使用偶联剂，所述偶联剂选自下列中的一种及其任意组合： HOBt,HOAt,DIC,EDC,BMC,BEC,PIC,PEC,PyBOP,PyAOP,HATU,HBTU,TBTU,TDBTU, HOOBt，Oxyma。在b)步骤中可以使用含有TFA的酸解切肽试剂对肽树脂进行切割及侧链 去保护。
[0019] 另一方面，通过进一步的工艺研究，我们惊奇地发现，当使用Oxyma+X(X=DIC, DCC，EDC,BMC,BEC，PIC,PEC中的一种）作为偶联剂进行地加瑞克Fmoc固相合成，其工 艺杂质显著减少，产品纯度和收率明显提高。地加瑞克的合成中使用偶联剂Oxyma+X有两 个显著优点：a)Oxyma作为偶联剂用来替代富氮的HOBt，这使得用于大规模的工业生产工 艺更安全；HOBt已经被归类为UN0508 1.3C类