已经失活的经基因修饰的猪。 所述方法进一步包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且⑶163基因的 至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪相互交配以产生F2子代并且筛选F2子代以 鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修 饰的猪。
[0031] 本发明还涉及另一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个 等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或 使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的⑶163蛋白。这种方法包括使其中SIGLEC1基 因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与其中CD163基因的两个等位基因已经失 活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，使F1子代交配以产生F2子代，并且筛选F2子代 以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因 修饰的猪。
[0032] 本发明还涉及又一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个 等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或 使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的⑶163蛋白。所述方法包括使其中SIGLEC1基 因的至少一个等位基因和⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与 另一其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的 经基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且筛选F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等 位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
[0033] 在其它方面，本发明涉及通过以上任一方法产生的经基因修饰的猪的子代，其中 SIGLEC1基因的一个或两个等位基因已经失活和/或其中⑶163基因的一个或两个等位 基因已经失活，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
[0034] 其它目标和特征部分将显而易见而部分在下文中指出。
[0035] 附图简述
[0036] 图1描绘了唾液酸粘附素基因的构成和靶向载体设计。图1A和1B为示意图，显示 人（图1A)和小鼠（图1B)唾液酸粘附素基因分别由21个外显子构成并且跨距约20kb。图 1C示出了对外显子2的鼠突变分析（如图1C所示的外显子2的DNA序列为SEQIDN0:7， 并且如图1C所示的外显子2编码的氨基酸序列为SEQIDN0:8)。突变分析显示出使唾 液酸粘附素与配体结合的6个氨基酸（用加方框/粗体文本示出）。图1D描绘了用于将 SIGLEC1的外显子1的一部分和外显子2和3置换为终止密码子的靶向载体设计。载体还 包括PGK启动子驱动的新霉素（neo)选择盒。
[0037] 图2描绘了靶向载体设计、唾液酸粘附素基因的构成和经改变的唾液酸粘附素基 因的构成。
[0038] 图3是显示为鉴定唾液酸粘附素基因的靶向的PCR筛选的凝胶照片。
[0039] 图4是显示为鉴定野生型和靶向唾液酸粘附素等位基因同等存在的PCR筛选的凝 胶照片。
[0040] 图5描绘了含有9个胞外SRCR结构域、2个脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸（PST)富集结 构域、跨膜区域和胞内胞质尾区的野生型CD163(左）的结构域构成。右侧描绘了经基因修 饰的⑶163。除SRCR结构域5已经被来自⑶163配体（⑶163L)的SRCR结构域8置换外， 结构域构成仍然相同。
[0041]图6描绘了⑶163靶向载体，其中所述载体的臂是与自然存在的或野生型⑶163 有相同序列的DNA部分，从而允许载体退火为细胞中已经存在的CD163。然后通过同源重组 使位于⑶163两臂之间经修饰的DNA插入细胞的DNA中。
[0042] 定义
[0043] "敲除猪"是基因的一个或两个等位基因的功能已经（例如）通过部分或完全基因 删除改变的经基因修饰的猪。如果敲除基因的一个等位基因，猪为该基因敲除的杂合子；如 果敲除两个等位基因，猪为基因敲除的纯合子。
[0044] 术语"供体细胞"指从中得到核或染色质材料，用于核转移的细胞。如本文其它地 方所讨论，核转移可牵涉核或染色质的转移（只有当从供体细胞分离时）或包括此类核或 染色质材料的整个供体细胞的转移。
[0045] 术语"基因修饰"指基因序列（包括编码序列和非编码序列，例如内含子、启动子 序列及5'和3' -非翻译序列）中改变基因表达或活性的一个或多个改变。此类修饰包括 (例如）插入（例如，插入异源序列例如可选标记和/或终止信号）、删除、移码突变、无义 突变、错义突变、点突变或其组合。
[0046] 术语"受体细胞"指向其中引入供体细胞、供体细胞核或供体细胞染色质的细胞。 在核转移之前适当地为受体细胞去核。受体细胞的实例包括卵母细胞、受精卵和两-细胞 胚胎的细胞。
[0047] "小干扰RNA"（siRNA)指具有特异性干扰蛋白质表达的能力的双链RNA分子。 siRNA长度通常从约10个至约30个核苷酸。siRNA分子的长度基于siRNA分子的反义链 的长度。
[0048] 优选实施方案描述
[0049] 本发明涉及抗猪呼吸与生殖综合征病毒（PRRSV)感染的经基因修饰的猪。PRRSV 感染性由三种特定进入介体产生：（1)与硫酸乙酰肝素的首次结合，（2)受唾液酸粘附素 (SIGLEC1)结合/内在化，和（3)CD163使病毒内在化/脱壳。因此，防止PRRSV与SIGLEC1 和/或PRRSV与⑶163之间的相互作用导致PRRSV不能在宿主中建立感染。同样，本发明涉 及其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或其中⑶163基因的至少一个等位 基因已经失活的经基因修饰的猪，其中⑶163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生 殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的⑶163蛋白。这些猪也可称为SIGLEC1和/或⑶163 的敲除猪。
[0050] 本发明包括其中只有靶基因（SIGLEC1和/或⑶163)的一个等位基因已经失活， 而其它等位基因仍未受影响的猪。这些动物，本文称为"杂合子"或"半合子"动物，可用于 育种法中以产生纯合子突变体。本发明还包括纯合子突变猪，其中通过相同或不同方法使 靶基因的两个等位基因失活。相应地，本发明包括经基因修饰的猪，其中：（1)SIGLEC1基因 的一个等位基因已经失活；（2)⑶163基因的一个等位基因已经失活；（3)SIGLEC1基因的两 个等位基因已经失活；（4)⑶163基因的两个等位基因已经失活；（5)SIGLEC1基因的两个等 位基因和⑶163基因的一个等位基因已经失活；（6)SIGLEC1基因的一个等位基因和⑶163 基因的两个等位基因已经失活；（7)SIGLEC1基因的一个等位基因和⑶163基因的一个等位 基因已经失活；或（8)SIGLEC1基因的两个等位基因和⑶163基因的两个等位基因已经失 活。一般在这些情况的每一种下和本申请的上下文中，⑶163等位基因的失活产生不能结 合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
[0051] 为获得本发明的动物进行的基因打靶可通过破坏、去除、修饰或置换靶基因序列 导致基因失活。基因失活的方法在本领域中众所周知。例如，可通过向靶基因中插入异源 序列（例如可选标记和/或终止密码子），删除基因的一部分或整个基因，修饰基因（例如 通过移码突变、无义突变、错义突变、点突变、用另一核酸序列置换一部分或整个基因）或 以上任何组合使靶基因失活。
[0052] 根据靶向构造的设计，插入序列可置换基因中先前存在的序列或可添加到此类序 列中。根据是期望完全敲除基因的功能还是期望维持一定水平降低的功能，可改变靶向构 造的设计。在SIGLEC1的情况下，功能的完全敲除可取。通过举例的方法而非限制，可通过 删除外显子1的一部分和所有外显子2和3,例如通过用新霉素可选盒置换外显子1的一部 分和所有外显子2和3敲除SIGLEC1基因。在一些实施方案中，修饰也可包括在要突变的 SIGLEC1基因的序列的任一侧添加LoxP位点。在一些情况下，靶向构造可含有在待插入序 列侧面的loxP位点和CRE重组酶。在其它情况下，可使用两-载体系统，其中靶向构造包 括在待插入序列侧面的loxP位点并且第二载体包括编码CRE重组酶的转基因。可将CRE 重组酶的转基因置于组织特异性启动子的影响下，以致其表达使得SIGLEC1基因在特定细 胞谱系中无功能。类似地，抗生素可选盒两侧可为loxP位点，以便后来可使用Cre重组酶 将其删除。
[0053] 在CD163的情况下，期望仅仅使其与PRRSV结合和/或脱壳相关的功能失活，而留 下CD163的其它功能受最小影响或不受影响。虽然不受任何特定理论约束，但是由于CD163 在血红蛋白-触珠蛋白复合物的结合和内在化中的作用，认为CD163完全敲除可能不能活 或可能严重受损。相应地，通过破坏先前证实在PRRSV感染中起主导作用（VanGorp等， 2010)的⑶163的第五个N端清道夫受体富半胱氨酸（SRCR)结构域，而留下其它结构域不 受影响使CD163失活。可通过（例如）引入改变该结构域的结构的点突变或通过用另一结 构域交换该结构域基因修饰SRCR结构域5。例如，因为已经证实该结构域"交换"使培养细 胞中的相对PRRSV感染性降低至0%，所以可用来自CD163配体（CD163L)的SRCR结构域8 置换SRCR结构域 5(VanGorp等 2010)。
[0054] 在其它方法中，靶基因的编码序列并未改变或改变最小，而靶向影响靶基因表达 的序列，例如启动子序列。在任何情况下，为利于鉴定其中已经发生靶向的细胞，可选标记 插入往往的可取的。若需要，稍后可通过（例如）Cre-L〇X或类似系统去除此类标记或其它 插入序列。
[0055] 靶向基因修饰使用具有与靶基因（例如，SIGLEC1或⑶163)或靶基因的侧翼区有 同源性的区域的核酸构造，使得所述构造整合至基因组中通过改变基因的序列和/或通过 改变基因的表达水平改变基因的表达。因此，为了改变基因，通常将靶向构造设计为含有三 个主要区域：（i)与要靶向的基因座（例如，SIGLEC1或CD163基因或其侧翼序列）同源的 第一区域，（ii)为特异性置换靶向基因座的一部分或插入靶向基因座的异源多核苷酸序列 (例如，编码可选标记例如抗生素抗性蛋白）的第二区域，和（iii)和第一区域一样，与靶向 基因座同源，但是通常与构造的第一区域不连续的第三区域。靶向构造与靶向野生型基因 座之间的同源重组导致在靶向载体中表现出同源性的两个区域之间任一基因座序列的缺 失，异源序列置换该序列或异源序列插入该序列（例如，编码可选标记的异源序列）。在实 施例1中描述了进行此类靶向修饰的示例性构造和载体；然而，在本领域中已知可用于此 类方法的其它载体并且可容易地适用于本发明。
[0056] 为了促进同源重组，靶向载体的第一和第三区域（见上文）包括表现出与待靶向 基因（或侧翼区）的大体序列同一性的序列。例如，靶向载体的第一和第三区域可具有 与靶向基因或侧翼区至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或 约100%相同的序列。通常使用其中指定了缺省参数的BLAS'r:(基本局部比对搜索工 具）或BLAST? 2 测量序列同一性（见，Altschul等，J.Mol.Biol. 215:403-410, 1990 ;Tatiana等，FEMSMicrobiol.Lett. 174:247-250, 1999)。因此，与靶向基因座有至少约 80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或甚至约100%序列同一性的序 列可用于本发明中以促进同源重组。
[0057] 同源的两个区域（S卩，上述第一和第三区域）的总尺寸可为（例如）约2千碱基 (kb)至约25kb(例如，约4kb至约20kb，约5kb至约15kb或约6kb至约10kb)。置换革巴向 基因座的一部分或插入靶向基因座的区域的尺寸（如上所述的第二区域）可为（例如）约 0. 5kb至约5kb(例如，约lkb至约4kb或约3至约4kb)。
[0058] 可使用各种类型的靶向构造递送方法。可使用细胞转染法，包括磷酸钙、脂质转 染、电穿孔和注核，递送靶向构造。如果在正在使用的细胞类型中所述基因有转录活性，则 可采用无启动子可选标记策略，以便将仅在在转录单元中有重组事件的细胞中发现抗生素 抗性。可选地，如果在正在使用的细胞类型中所述基因无转录活性，可使用为诱导型、组织 特异性或含有绝缘子例如基质结合区（MAR)的启动子。
[0059] 可选地，siRNA技术可用于"沉默"SIGLEC1的转录产物。反义技术在本领域中众 所周知。简言之，使用通常含有约19至约29个核苷酸，与SIGLEC1的有义mRNA序列互补 的核苷酸序列。互补性程度范围通常从约70%到约100%。优选地，互补性大于约80%，更 优选地大于约90%，并且甚至更优选地大于约95%。通过比较设计成与SIGLEClmRNA的不 同区域互补的几种反义序列防止SIGLEC1蛋白生成的效力，可容易地确定SIGLEClmRNA适 合用siRNA靶向的区域。可通过本领域的任何已知技术容易地进行此类实验，无需过度实 验。
[0060] 用于siRNA表达的载体在本领域中众所周知。载体可为整合至宿主基因组中或保 持为附加体形式的任何环状或线性长度的DNA。一般而言，siRNA表达盒可连接至DNA转移 载体中，例如质粒或慢病毒、腺病毒、甲病毒、逆转录病毒或其它病毒载体。示例性哺乳动物 病毒载体系统包括腺病毒载体；腺相关1型（"AAV-1"）或腺相关2型（"AAV-2"）病毒载 体；丁型肝炎载体；活减毒丁型病毒；疱疹病毒载体；甲病毒载体；或逆转录病毒载体（包 括慢病毒载体）。
[0061 ] 可根据本领域已知的标准技术进行哺乳动物细胞的转化。任何众所周知的将外 源核苷酸序列引入宿主细胞的过程均可使用，只要它们至少成功地将siRNA构造引入宿主 细胞中。这些过程包括使用病毒转导（例如，通过使用前一段落中所列的任何病毒载体， 例如通过逆转录病毒感染，任选在聚凝胺的存在下以增强感染效率）、磷酸钙转染、电穿孔、 生物溶解颗粒递送系统（即，基因枪）、脂质体、显微注射和任何其它已知的将克隆的基因 组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞中的方法。在本发明中，将针对 SIGLEC1的siRNA引入供体猪成纤维细胞中，随后用于产生本发明的经转基因修饰的猪。
[0062] 可使用下列通用的体细胞核转移过程获得本发明的转基因猪。简言之，通过如上 所述的基因打靶基因修饰猪体细胞（例如，胎儿成纤维细胞）的基因组，以产生供体细胞。 然后将此类经基因修饰的供体细胞的核（或整个供体细胞，包括核）转移到受体细胞，例如 去核卵母细胞中。供体细胞可与去核卵母细胞融合，或可将供体核或供体细胞本身注入受 体细胞中或注入与卵母细胞膜相邻的卵周隙。
[0063] 因此，获得已经靶向靶基因（如上所述，一个或两个等位基因）的体细胞后，可进 行核转移。任选地，在核转移之前可冷藏经基因修饰的供体细胞。可使用的受体细胞包括 卵母细胞、已受精的受精卵或两-细胞胚胎的细胞，其全部可能已经去核或可能未去核。
[0064] 受体卵母细胞可使用本领域已知的方法获得或可从商业来源（例如，BoMed Inc.，Madison，Wis.)购买。可从"小母猪"，从来没有后代的母猪或从"大母猪"，先前已经 生产后代的母猪获得卵母细胞。
[0065] 相应地，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪可通 过为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因 组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因；并激活所述卵母细胞以产生胚胎来产生。类似 地，其中⑶163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，其中⑶163等位基 因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)脱壳的CD163蛋白，可 通过为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基 因组包含至少一个失活⑶163等位基因；并激活所述卵母细胞以产生胚胎来产生。两种 方法可进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道，其中所述代孕猪已经开始发情但尚 未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩所述胚胎产生其基因组包含至少一个失活SIGLEC1 和/或⑶163等位基因的经基因修饰的猪。