体的摩尔比为3:1。
[0054]步骤1-3、将连接产物转入大肠杆菌D册a中，125巧m，37°C，培养比，将转化产 物涂布于含有lOOmg/mL氨节青霉素的LB培养板中，37°C倒置培养16小时。挑取单克 隆，扩大培养后WIL-6启动子序列-630-+57引物进行PCR检测，选取阳性克隆提取质粒 进行化nI和化OI酶切鉴定，阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果对比正确质粒即为 IL-6-promotor-pGL6质粒。 阳化日]步骤2，将比-6-promotor-pGL6质粒转染入人气道上皮细胞16皿E中，得到 比-G-promotor-p化6-16皿E细胞。
[0056] 步骤2-1，将人气道上皮细胞16皿E细胞培养于RPMI1640+10 %FBS完全培养基 中。消化细胞，W2X10^孔的密度接种于12孔板中，采用Lipofectamine3000转染试剂， 将IL-6-promotor-pGL6质粒转染入16皿E细胞中。
[0057] 转染体系如下：
[0058] Opti-MEM 50yL；
[0059] 比-G-promotor-pGLG质粒 lug;
[0060] P3000 试剂 2yL;
[0061] 上述=者混匀为溶液①
[0062] Opti-MEM 50yL；
[0063] LipofectaminSOOOLSuLo
[0064] 上述二者混匀为溶液② 阳0化]溶液①与溶液②混匀，室溫解育5min。
[0066] 步骤2-2,转染24小时后，将细胞培养液换成含有80化g/mLG418的培养基进行细 胞筛选，每2天换一次细胞培养液，连续筛选两周至阴性克隆细胞死亡。
[0067] 步骤2-3,撤去筛选压力，更换成完全培养基，扩增剩余阳性16皿E细胞即为稳定 转染的IL-G-promotor-pGLG的阳性细胞。
[0068] 步骤3,将比-6-promotor-p化6-16皿E细胞W5000/孔的密度接种于24孔板中， 培养12小时后，更换成低血清培养基RPMI1640+1 %FBS饥饿培养12小时，W不对人气道上 皮细胞16皿E产生细胞毒性的最大量为基准，分别加入1、0. 1、0.Ol倍的烟气芳香胺类化合 物（W3%卷烟提取物CSE作为阳性对照），作用48小时。 W例为了确定检测剂量，对卷烟烟气中芳香胺类化合物对16皿E细胞毒性作用进行检 ，方法如下： 阳070] (1) 16皿E细胞W1500/孔的密度，180yL体积接种入96孔细胞培养板中，培养24 小时。
[0071] (2)加入芳香胺类化合物（本实施例为1-氨基糞和3-氨基联苯），使每种化合物 的终浓度分别为 100yM、50yM、10yM、5yM、lyM、0. 5yM、0. 1yM、0. 05^]?、0^]\1，继续培 养72小时后，每孔加入20yL5mg/mLMTT，解育4小时。
[0072] (3)取出培养板，弃去培养基，每孔加入200yLDMSO溶解3min，测定0D490皿。取 对16皿E细胞不产生细胞毒作用的最高浓度为检测剂量。
[0073] 步骤4,取出培养板，去除培养基上清。PBS洗涂一次，加入IOOiiL巧光素酶裂解 液室溫裂解20min，取20yL裂解液，加入50yL巧光素酶底物，采用化学发光仪测定巧光素 酶活性，测定时间lOsec。
[0074] 诱导IL-6表达倍数=筛选芳香胺类化合物巧光素酶值/空白对照组巧光素酶值 平均值，诱导IL-6表达倍数反映了相应的芳香胺类化合物对人气道上皮细胞中IL-6的诱 导作用。 阳〇7引结果分析 阳076] (1) 1-氨基糞和3-氨基联苯对16皿E细胞毒作用 阳077] 如图Ia所示，1-氨基糞在50yM、100yM对16皿E细胞具有显著细胞毒作用，故筛 选该化合物是否诱导IL-6表达时选择浓度为10yM、1yM、0. 1yM。
[0078] 如图化所示，3-氨基联苯在IOyM、50yM、IOOyM时对16皿E具有显著细胞毒作 用，故筛选该化合物是否诱导IL-6表达时选择浓度为5yM、0. 5yM、0. 05yM。 阳0巧](2) 1-氨基糞和3-氨基联苯对16皿E中IL-6表达诱导作用 阳080] 如图2a所示，1-氨基糞W10yM、liiM、0. 1iiMS个浓度作用于 比-6-promotor-P化6-16皿E稳定转染细胞48小时，能剂量依赖性诱导16皿E细胞中比-6 表达，且10yM时诱导作用达到最强，诱导作用达到2. 28 ±0.12倍，与对照组相比具有显著 差异。
[0081] 如图2b所示，3-氨基联苯W5yM、0. 5yM、0.OSyMS个浓度作用于 比-6-promotor-P化6-16皿E稳定转染细胞48小时，能剂量依赖性诱导16皿E细胞中比-6 表达，且5yM时诱导作用达到最强，诱导作用达到1. 61 ±0. 14倍，与对照组相比具有显著 差异。
[0082] 选取3%C沈作为阳性对照，其对16皿E中IL-6具有强的诱导作用，与对照组相比 具有显著差异。
【主权项】
1. 一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的检测方法，其特 征在于，包括： 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL-6启动子的IL-6-promotor-pGL6质粒； 步骤2,将IL-6-promotor-pGL6质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到IL-6-promotor-pGL6-16HBE细胞； 步骤3,在IL-6-promotor-pGL6-16HBE细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合物，作 用至少48h; 步骤4,对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性，得到 上皮细胞中IL-6的诱导表达倍数。2. 如权利要求1所述的卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的 检测方法，其特征在于，IL-6-promotor-pGL6质粒的构建方法如下： 步骤1-1、设计IL-6启动子-630-+57的引物序列如下： 上游引物为：5' -ATGGTACCTGGAGACGCGITGAA-3'； 下游引物为：5' -CGCTCGAGGGGAGATAGAGCTTC-3'； 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增IL-6启动子序列； 步骤1-2、利用KpnI和XholI双酶切步骤1-1的PCR产物和质粒载体pGL6,用T4DNA连接酶连接至少24h，得到IL-6-promotor_pGL6质粒。3. 如权利要求2所述的卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的 检测方法，其特征在于，步骤1-1中PCR反应的条件如下：变性、退火、延伸循环28~30次。4. 如权利要求2所述的卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的 检测方法，其特征在于，PCR产物与pGL6载体的摩尔比为3:1。5. 如权利要求1所述的卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的 检测方法，其特征在于，利用Lipofectamine3000转染试剂将IL-6-promotor_pGL6质粒转 染入人气道上皮细胞16HBE中，然后采用G418筛选得到IL-6-promotor-pGL6-16HBE细胞。6. 如权利要求1所述的卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的 检测方法，其特征在于，步骤3中，芳香胺类化合物的加入量为不对人气道上皮细胞16HBE 产生细胞毒性的最大量。
【专利摘要】本发明公开了一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-6表达的检测方法，包括：步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL-6启动子的质粒；步骤2，将步骤1所得质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到IL-6-promotor-pGL6-16HBE细胞；步骤3，在步骤2所得细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合物，作用至少48h；步骤4，对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性，得到上皮细胞中IL-6的诱导表达倍数。本发明提供的检测方法，操作简单，方便快速，灵敏度高，能够准确检测卷烟主流烟气中芳香胺类物质对人气道上皮细胞中IL-6表达的诱导作用。
【IPC分类】C12N15/85, C12Q1/02, C12Q1/68, C12Q1/66
【公开号】CN105219866
【申请号】CN201510730802
【发明人】肖卫强, 周国俊, 储国海, 胡安福, 黄芳芳, 李霞, 许成云, 吴希美
【申请人】浙江中烟工业有限责任公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月30日