:抗GATA3单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选
[0044] 根据标准方法用重组产生的纯化的GATA3蛋白片段用于对B6/C57小鼠（北京维 通利华实验动物技术有限公司）进行免疫。具体方法如下：
[0045] 1、动物免疫：经过纯化的GATA3抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射 方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不 完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血 清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
[0046] 2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0,融合时处于对数生长期；取 已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混 合，滴加37°C的50%PEG(PH8. 0)lmL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加 入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3. 5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37°C、 5% 0)2恒温培养箱中进行培养。
[0047] 3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用GATA3纯化重组蛋白进行 ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA 值，挑取0D280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为 阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为0TI5C11。
[0048] 4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5ml降植 烧，一周后每只小鼠用lmL注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为 5X106/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进 行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株0TI5C11产生的单抗亚型为IgG2b，采用 proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、WB检测特异性、分装、冻存在-20°C。其中 WB检测特异性结果见图4。
[0049] 由图4结果可见，0TI5C11分泌产生的单抗可特异地识别293T细胞过表达的全长 GATA3以及MCF7细胞中内源的GATA3蛋白，表明所述单克隆抗体能特异地Westernblot检 测完整的GATA3蛋白。
[0050] 实施例4 :0TI5C11分泌的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测
[0051] (1)、实验方法：
[0052] 1、取福尔马林固定的成人前列腺、肾癌、膀胱癌等组织块进行石蜡包埋，使用 Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。
[0053] 2、脱錯与水化：分析纯二甲苯3XlOmin，无水乙醇3XlOmin，95%乙醇5min，85% 乙醇5min，75%乙醇5min，去离子水浸泡3minX3次
[0054] 3、加入抗原修复液（ImMEDTA, 10mMTrisbuffer(pH8. 5))高压锅高压热修复 3min，待高压锅温度降至约90°C时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水 浸泡3minX3次。
[0055] 4、使用3%过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置lOmin。去离子水浸泡 5minX3 次。
[0056] 5、加上封闭液$83+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清），37°(：孵育6〇1^11。
[0057] 6、去除封闭液，勿冲洗，加入抗GATA3单抗（0TI5C11分泌产生），稀释比：1:200， 使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37°C孵育60min。PBST(0. 1%Tween-20)洗涤2次，每 次洗涤 5min。PBST(0. 02%Tween-20)洗涤 1 次，每次洗涤 5min。
[0058] 7、滴加Polink-试剂盒 2(CatlogNo.D37-15)试剂 1，37°C孵育 10-20 分钟。使 用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒（CatlogNo.D37-15)试剂2, 37°C孵育 10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。
[0059] 8、应用DAB溶液（中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3~10min。蒸馏水洗涤。
[0060] 9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1 %盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置 lmin〇
[0061] 10、脱水和透明：75%乙醇5min，100%乙醇5minX3次，85%乙醇5min，95%乙醇 5min，100%乙醇3X5min;二甲苯3X5min，中性树胶封片。
[0062] 11、镜检，见图 5-7。
[0063] (2)、实验结果：
[0064] 由图5-7结果可见，在成人前列腺、肾癌、膀胱癌组织中可见到特异性细胞核染 色，图中箭头所指。结果与GATA3在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明本发明所述 杂交瘤细胞0TI5C11分泌产生的单克隆抗体可用于免疫组织化学检测GATA3蛋白的水平。
[0065] 实施例5 :0TI5C11分泌产生的单克隆抗体的特异性蛋白芯片检测
[0066] OriGene高密度蛋白芯片上包含10, 000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种 蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一 钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩 阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免 疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白（OriGeneCat PA100001)芯片进行0TI5C11抗体鉴定实验的实验方法：
[0067] 1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床 上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用lOmLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。
[0068] 2、向50mL离心管中加入40mL5%脱脂牛奶（用PBST进行稀释）置于摇床上，室温 封闭30分钟。
[0069] 3、使用封闭液（5%脱脂牛奶）稀释一抗0TI5C11，稀释比列为1:100。
[0070] 4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL-抗在封口膜上。
[0071] 5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触 抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗 溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4°C环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯 片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。
[0072] 6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。 使用40mLPBST(0. 1%Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤 5min〇
[0073] 7、使用封闭液（5%脱脂牛奶）稀释二抗DyLight649_conjugatedAffiniPure FragmentGoat-anti-MouseIgG，稀释比例为 1:400。
[0074] 8、按照上述步骤4,步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝 箱纸遮盖，以防止发生信号漂白。
[0075] 9、按照上述步骤6,使用PBST洗涤芯片。
[0076] 10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。
[0077] 11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。
[0078] 12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。
[0079] 13、根据BSA_Cy3以及BSA_Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。
[0080] 14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对 应蛋白名称，NCBI录入号（accessionnumber)，蛋白ID，蛋白大小等信息。
[0081] 结果如图8所示，单抗0TI5C11在OriGene蛋白芯片上能特异地识别GATA3蛋白， 而与其他近10000种蛋白无交叉反应，表明单抗0TI5C11的特异性较好。
[0082] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO:11087。2. 保藏编号为CGMCCNO:11087的杂交瘤细胞在制备抗GATA3蛋白单克隆抗体中的应 用。3. 抗GATA3蛋白单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNO:11087的杂交瘤细 胞分泌产生。4. 保藏编号为CGMCCNO:11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体在 制备检测GATA3蛋白的免疫检测产品中的应用。5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。6. -种检测GATA3蛋白的免疫组化检测试剂盒，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC NO:11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体。7. 保藏编号为CGMCCNO:11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体在 制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。8. 根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括以下组织细胞的肿瘤： 乳腺、前列腺、膀胱、皮肤、肾脏、大血管上皮、淋巴细胞。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，公开了抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用。本发明所述抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC？No.11087。本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗GATA3蛋白单克隆抗体，且与GATA3蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了GATA3蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内GATA3蛋白表达水平，可应用于检测前列腺、膀胱、乳腺、皮肤、肾脏、大血管上皮以及淋巴细胞等相关肿瘤组织中GATA3的表达水平。CGMCC No.1108720150703
【IPC分类】G01N33/574, C07K16/18, G01N33/68, C12N5/20, C12R1/91, G01N33/577
【公开号】CN105274060
【申请号】CN201510702680
【发明人】何为无, 马东晖, 袁克湖, 魏海涛, 陈才伟, 王宜, 褚伯阳, 王广力, 舒又敏
【申请人】无锡傲锐东源生物科技有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月26日