肥.88,dd，J= 10. 5,7. 3)与C-21和C-22的相关性，可推断巧喃环位于C-17 位上。通过核磁数据分析可知该化合物是一个B环开环的巧樣苦素类化合物。此外，该化 合物含有一个异下酷氧基结构。HMBC谱中Me-3'（0. 80,山J= 7.OHz)，Me-4' (0. 81，山J =7.OHz)和H-2'（1. 98,m)与C-r( 5C175. 5)的相关性验证了上述推论。通过HMBC谱 中Me-18与C-12 ;H-12与C-r的交叉峰可知异下酷氧基片段位于C-12位上。HMBC谱中， Me-19 ( 5m. 55,S)和H-9 ( 5 册.32,d，J= 7.細Z)与C-I( 5C77. 7) ;H-1 ( 5 册.42,d，J= 4.OHz)和H-Il(S册.28,dd，J= 11.0,7.細Z)与其相应的乙酷幾基（5C169. 6,174. 5) 的相关性，W及电-古COSY谱中H-I与 &-2(S肥.39,dd，J= 15. 0,4.OHz;2.86,d，J= 15. 0)的交叉峰，表明C-I和C-Il(5C71. 7)位分别连有一个乙酷氧基。HMBC谱中，H-1， Me-28(S册.91，S)和Me-29( 5m. 02,S)与C-3( 5C211.6)的相关性表明C-3 为酬幾基。 R犯SY谱中，Me-19与Me-29和H-12;W及H-12和H-17相关性表明它们为0构型。此外， R犯SY谱中H-9( 5 册.32,d，J= 7.細Z)与H-I;H-9 与H-Il;H-9 与H-5( 5 肥.33,d，J= 7.5化）出-5与]?6-28^及护11与]\16-18(5册.83,3)的交叉峰表明它们均为〇-构型。运 些结果与关键质子CL,U= 7.6化和Jii,12= 11.OHz)之间较大的禪合常数相吻合。综合氨 谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1 所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[00巧]实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0026] -、材料和仪器
[0027] 人厮静脉内皮细胞珠（HUVEC)由上海午立生物技术有限公司细胞库提供。化合物 (I)自制，HPLC归一化纯度大于98%dRPMI-1640培养基、MTT、二甲基亚讽均购于Sigma公 司。胎牛血清购于Hy化one公司。FITC标记羊抗兔IgG、兔抗人第八因子相关抗原购于北京 博奥森生物技术有限公司。MDA含量检测试剂盒购于南京建成生物研究所。AnnexinV-門TC 调亡检测试剂盒购于Centrebio公司。乙二胺四乙酸巧DTA)购于广州威佳科技有限公司。
[0028]DK-8AD型电热恒溫水槽（上海一恒科学仪器有限公司），ER-120A型电子分析天平 (岛津公司），6219型电子抑计（上海任氏电子有限公司），高速低溫离屯、机（Sigma公司）， L420台式低速自动平衡离屯、机（湘仪离屯、机仪器有限公司），SYC-2101水平摇床（其林贝 尔仪器制造有限公司），1000yL微量加样枪Xl支、20-100yL微量加样枪Xl支、1-20yL 微量加样枪X1支（法国吉而森公司），C〇2(培养箱化raeus公司），超净台（苏净集团安 泰公司），倒置相差显微镜（德国莱卡公司），酶标仪（Sigma公司），FACS化Libur(流式细 胞仪）。
[0029] 二、试验方法
[0030] 1、厮静脉内皮细胞的培养
[0031] 1.1培养条件
[0032] 将新购入的HUVEC细胞株接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。置于 37°C，5 %C〇2培养箱中，每2天更换I次培养基。
[0033] 1. 2细胞传代
[0034] 取一瓶HUVEC在倒置相差显微镜下观察细胞，如长成致密的单层，即可进行传代； 将培养瓶轻轻摇动数次，悬浮起浮在细胞表面的碎片，然后连培养液一起倒出，吸取2~ SmLPBS液加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，重复3次；加入ImL0.25%膜酶，W能覆盖瓶底 为限，转动培养瓶，使湿润整个细胞层，置37°C解育箱内消化2~3min，待确认细胞己收缩 变圆时为止；加ImL培养液于培养瓶中终止消化，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细 胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液，注入离屯、管离屯、（8(K)r/min，5min)后弃去上清液；加入 3mL培养液于离屯、管中，用吸管吸取培养液轻轻吹打数次，使细胞悬重，然后按1:3或1:4分 配传代培养；置于解育箱内37°C、5 %C〇2恒溫箱中培养，24h后换液，通常3-4天可形成单 层，此时便可换维持液供实验用。
[0035] 1. 3HUVEC的计数
[0036] 首先取待测的细胞悬液50yL滴入细胞计数板内，按白细胞计数法，于低倍镜下 计数4角的4个大方格内的细胞总数，然后用W下公式计算细胞浓度：4个大方格内的活细 胞数/4XIO4 =细胞数/mL
[0037] 2、厮静脉内皮细胞的鉴定
[0038] 在6孔培养板内放置无菌盖玻片IcmX1畑1，将内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待 内皮细胞长至汇合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗盖玻片，放入100%丙酬中固定15min， 用PBS冲洗3次，每次2min，滴加3 %的&〇2室溫解育8min，PBS冲洗3次，每次2min，滴加 兔抗人棚因子单克隆抗体（1:100)，另一盖玻片上不加一抗作阴性对照4°C过夜。次日，用 PBS冲洗3次，每次2min，滴加FITC标一记的羊抗兔IgG, 37°C解育60min，用PBS冲洗3次， 每次2min，巧光显微镜下观察并拍照。
[0039] 3、利用MTT比色法测定HUVEC的细胞活性 W40] 3. 1利用MTT比色法观察不同浓化合物（I)对厮静脉内皮细胞活性的影响
[0041] 3. 1.1传代培养 阳0创将HUVEC按2XlOVmL的密度用含10%FBS的RPMI-1640培养基接种于96孔板， 每孔种植200UL。
[0043] 3. 1. 2分组加药
[0044] 传代细胞培养24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机 分为6组：对照组（control)，化合物（I) 5Jig/mL组，化合物（I) 10Jig/mL组，化合物 (I)20iig/血组，化合物（IMOiig/血组，化合物（I)80iig/血组，每孔6孔。继续培 养48小时后，MlT法检测细胞活性。
[0045] 3. 1. 3MTT法检测
[0046] 直接向每孔加入20yL己配制好的MT溶液，37°C解育地，吸净上清，然后加入 150yLDMS0。待结晶充分溶解后，利用酶标仪在波长490nm处测定OD值。
[0047] 3. 2利用MTT比色法观察不同浓度OX-LDL对厮静脉内皮细胞活性的影响 W4引 3. 2. 1传代培养：同上。
[0049] 3. 2. 2分组加药
[0050]细胞培养24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6 组：对照组（control)，OX-LDL(为自制）10Jig/mL组，OX-LDL 20Jig/mL组，OX-LDL 40Jig/ ml组，OX-LDL 80 y g/血组，OX-LDL 160 y g/血组，每孔6孔。继续培养24小时，MTT法检 测细胞活性。
[0051] 3. 3利用MT比色法观察化合物（I)对OX-LDL诱导厮静脉内皮细胞损伤的干预 作用
[0052] 3.3. 1传代培养：同上。
[0053] 3. 3. 2分组加药
[0054] 细胞培养24h后，用10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6 组：对照组（control)，OX-LDL50Jig/血组，OX-LDL50Jig/mL+ 化合物（I) 5Jig/血组， OX-LDL50yg/mL+化合物（I)10yg/mL组，OX-LDL50yg/mL+化合物（I)20yg/mL每 孔6孔。继续培养24小时后，MlT法检测细胞活性。 阳化5] 4、利用流式细胞技术观察化合物（I)对OX-LDL诱导厮静脉内皮细胞调亡的干 预作
[0056] 4. 1用传代培养
[0057] 将HUVEC按2XIO5/血的密度用含10%FBS的RPMI-1640培养基接种于6孔板， 每孔种植1500yL。
[0058] 4. 2分组加药
[0059] 细胞培养24h后，WRPMI-1640无血清培养基血清剥夺2地，使细胞进入静止 状态。用含RPML-1640血清培养基配制药物，将细胞随机分为5组：对照组（control)， OX-LDL50yg/mL组，OX-LDL50yg/mL+ 化合物（I) 5yg/mL组，OX-LDL50yg/mL+ 化合 物（I)l〇Jig/mL组，OX-LDL50]ig/mL+化合物（I)20]ig/mL每孔加1血含药培养基。
[0060] 4. 3操作步骤
[0061] 加药后1化取材，把细胞培养液吸出至离屯、管内，PBS洗涂贴壁细胞一次，用膜酶 细胞消化液消化细胞。细胞消化下来后，转移到离屯、管内，PBS洗S次（1000 g离屯、10分 钟）。加入200yL结合缓冲液，重悬细胞。加入10yLAnnexinv-門TC、10yLPI染