用PBS冲洗2遍，加入含有MTT的营养液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔 内培养液。加入二甲基亚枫，置摇床上低速振荡l〇min，采用酶联免疫检测仪于490nm测吸 光度值（0D值）。计算细胞增殖抑制指数（IR，Inhibition rate)，即增殖抑制率，按下列公 式计算：
[0043] (4. 1)泥螺酶解粗提物抗肿瘤活性研究
[0044] 将匀浆好的泥螺用胰蛋白酶进行酶解，离心取上清液进行冷冻干燥，得到泥螺多 肽粗提物，采用MTT法观察其诱导肺癌H1299细胞株体外凋亡的影响。结果表明：随着多肽 浓度的增加抑制率逐渐增大，当浓度为5mg. mL 1时，增殖抑制率为35. 3%，当浓度为20mg. mL 1时，抑制率达到68. 7%，这说明此多肽具有一定的抗肺癌活性。如表1和图1所示。
[0045] 表1对肺癌细胞的抑制率（X土 s，η = 5)
[0047] 注：*与每个组分的最小的细胞抑制率相比，Ρ〈0. 05 ;与细胞共同培育36h后泥螺 多肽对H1299细胞增殖抑制的IC5Q2. 922mg/ml。
[0048] (4· 2)泥螺酶解多肽的膜分离组分抗肿瘤活性研究
[0049] 如实施例3所述步骤得到三个组分，分别是分子量10_5kd(Al)、5_3kd(A2)、小于 3kd (A3)，分别将各个组分进行冷冻干燥，并配制成20mg/mL的浓度进行MTT实验，作用36h 后，对H1299细胞的增殖抑制率为44. 6%、59. 5%、73. 4%。如图2所示，其中A3组分对 H1299细胞的抑制作用效果比其他两个组分要好。
[0050] (4. 3)凝胶层析组分的抗肿瘤活性研究
[0051] 经过超滤之后得到三个组分，由4. 2实验知A3组分对H1299细胞的抑制效果最 好，对A3组分大量收集，浓缩后进行冷冻干燥，选用凝胶Sephadex G-25层析按实施例3的 实验条件洗脱，得到三个组分HI、H2、H3,如图3所示。
[0052] 将各峰组分分别配成 5. Omg/mL、10.0 mg/mL、15. 0mg/mL、20.0 mg/mL 的浓度，用 MTT 法分别检测对肺癌H1299肿瘤细胞的增殖抑制作用，培养细胞24h后，把配好浓度的样品加 入细胞，设置空白对照组，通过SPSS软件对独立样本T检验分析，其它浓度组和该组有无显 著性差异，P〈〇. 05表明与空白对照组存在显著性差异。由表2绘制曲线图如图4、5所示， 其中图5中每个剂量组的柱条从左至右依次为HI、H2和H3。综合图表分析可得出，3种组 分对H1299肿瘤细胞有一定的抑制效果，且呈现出了量效关系，其中H2的抗肿瘤活性最高。 在20.0 mg/mL时，对肺癌H1299细胞的抑制率为73. 1 %，如表2所示。
[0053] 表2各组分对H1299细胞的增殖抑制率（) (η = 3)
[0055] 注：*与每个组分的最小的细胞抑制率相比，Ρ〈0. 05
[0056] (4. 4)反相高效液相色谱纯化组分的抗肿瘤活性研究
[0057] 经过4. 3实验可知Η2组分的抗肿瘤活性最好，对Η2组分进行进一步分离，经高效 液相色谱分别在214nm和280nm紫外波长检测比对，如图6所示标记，即依次得到F1和F2。
[0058] 经过凝胶层析分离得到的组分H2的活性最高，经过HPLC分离得到2个组分在浓 度为3mg/mL，作用24h后，对H1299细胞的增殖抑制率分别30. 04%和37. 08%，并绘制柱状 图，见图7。
[0059] 由图7中可以看出，组分F2对H1299肿瘤细胞的增殖抑制作用，强于F1组分的肿 瘤细胞抑制作用，将F1、F2组分进行收集并用PPSQ-31A对其进行结构检测，经检测F1的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所述，F2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
[0060] 上述各实施例所用实验材料和实验仪器如下：
[0061] 实验材料
[0062] 新鲜泥螺采集自浙江舟山近海海域；
[0063] 木瓜蛋白酶；胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）；
[0064] 甲醛（37. 0% -40. 0% );国药集团化学试剂有限公司；
[0065] 盐酸（36% -38% );国药集团化学试剂有限公司优级纯；
[0066] 氢氧化钠；无锡市晶科化工有限公司分析纯；
[0067] 四甲基偶氮唑蓝（MTT)，美国SIGMA公司；
[0068] F12粉末培养基，美国SIGMA公司；
[0069] RPMI1640 培养基，Gibco 公司；
[0070] 二甲基亚砜（DMSO)，美国SIGMA公司；
[0071] 乙臆，（CAN，Fisher Scientific 公司）
[0072] 三氟乙酸，（TFA，Merck公司）
[0073] 聚凝胺，（Polybrene，Shimadzu Corporation);
[0074] PTH-氨基酸标品，（PTH-AA，Shimadzu Corporation);
[0075] 实验仪器
[0076] BSZ-40-IXD自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；
[0077] Agilentl260(Agilent. USA)
[0078] 超滤杯、超滤膜，上海摩速科学器材有限公司；
[0079] G-25凝胶分子筛，北京亚太恒信生物科技有限公司；
[0080] FD-1000冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；
[0081] CF16RXII高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；
[0082] UV1100紫外分光光度计，上海美谱达公司；
[0083] BSA124S型电子天平，德国Sartorious AG公司；
[0084] VPWS-T-20L超纯水器，杭州永洁达净化科技有限公司；
[0085] ZHJH-C1209C型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；
[0086] 酶标仪，美国Bio-Rad公司产品；
[0087] Forma3111 型 C02 培养箱，美国 Thermo 公司；
[0088] 倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；
[0089] PPSQ-31A，（Shimadzu Corporation，日本）；
[0090] PTFE 滤膜，（PTFE filter，Shimadzu Corporation);
[0091] 玻璃纤维膜，（Glass Fiber Disk，Shimadzu Corporation);
[0092] 细胞株
[0093] 人肺癌细胞H-1299购于中国科学院上海细胞生物学细胞库。
【主权项】
1. 一种泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用。2. 如权利要求1所述的泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于所述 泥螺多肽通过以下步骤制得：新鲜泥螺洗净去壳，取泥螺组织捣碎，加入蒸馏水匀浆，料液 比为1: (3~4)，匀浆后调节匀浆液的pH值为8~9,加入0. 4~0. 5%匀浆液质量的胰蛋 白酶，40~50°C保温水解7~9h，水解完成后于95~100°C、10~15min进行灭酶，4°C下 水解液于9500~10000r/min离心15~20min，取上清液浓缩干燥得酶解粗提物，将酶解粗 提物溶于蒸馏水，分离纯化得各泥螺多肽组分。3. 如权利要求2所述的泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于：所 述酶解粗提物的浓度在5~25mg/ml时，对H1299细胞增殖抑制指数为35. 3~70. 5%，且 增殖抑制指数与酶解粗提物的浓度呈正相关。4. 如权利要求2或3所述的泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于： 所述分离纯化步骤为超滤或依次为超滤和凝胶层析或依次为超滤、凝胶层析及反相高效液 相色谱。5. 如权利要求4所述的泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于：所 述超滤步骤中分别使用l〇kd、5kd及3kd超滤膜，对应获得分子量为10~5kd的组分A1， 分子量为5~3kd的组分A2以及分子量小于3kd的组分A3, 20~25mg/ml组分A3作用于 H1299细胞36h后的增殖抑制率为70~75%，且增殖抑制指数与组分A3的浓度呈正相关。6. 如权利要求5所述的泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于：所 述凝胶层析中对组分A3进行洗脱，分别获得H1组分、H2组分和H3组分，其中5~20mg/ml 组分H2作用于H1299细胞24h后的增殖抑制指数为为44~83%，且增殖抑制指数与组分 H2的浓度呈正相关； 前述凝胶层析条件：选用SephadexG-25凝胶层析，装柱后用去离子水平衡，浓度为 50mg/mL、上样量为4mL、速度为3ml/min，流动相为超纯水，280nm紫外检测。7. 如权利要求6所述的泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于：采 用反相高效液相色谱分离所述H2组分，分离获得组分F1和F2,其中2. 5~3mg/ml组分F1 和组分F2分别作用H1299细胞24h后，对H1299细胞的增殖抑制指数分别为29~30. 04% 和 36 ~37. 08% ; 前述反相高效液相色谱条件：选用ZorbaxSB-C18(4. 6X250,5um);柱温为20°C;流动 相为1 %TFA和乙腈；梯度洗脱：从开始到30min结束，乙腈浓度从0变化到40%，洗脱速度 为1.OmL/min;进样体积为50ul;紫外检测波长分别为214nm、280nm。8. 如权利要求7所述的泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于：所 述组分F1的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述，组分F2的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所述。
【专利摘要】本发明涉及一种泥螺多肽在抗肺癌中的应用，尤其涉及泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物的应用。利用胰蛋白酶酶解法获取泥螺多肽粗提物，并且通过超滤法、凝胶柱分离法以及反相高效液相色谱技术等分离纯化手段获得各泥螺多肽组分，分别研究各分离组分对肺癌H1299细胞的增殖抑制性，研究发现各组分均能显著抑制肺癌H1299细胞增殖，对H1299细胞的增殖抑制指数可达44.6％以上。本发明原料成本低，提取条件简单温和，提取的泥螺多肽对肺癌H1299细胞增殖抑制效果显著，为开发以泥螺多肽为原料的抗肺癌药物提供理论依据。
【IPC分类】C07K1/16, C07K1/20, C07K1/34, C07K14/435, A61K38/17, C12P21/06, C07K1/36, A61P35/00
【公开号】CN105316380
【申请号】CN201410277550
【发明人】马剑茵, 曹玉昊, 胡俊峰, 林焕乐, 王铣
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年6月20日