L超纯水溶解，得粗提样II，置于4°C保存；
[0062](7)色谱层析树脂吸附与解吸:向1mL HZ_20ss色谱层析树脂中加入500 μ L粗提样II，4°C，10rpm静态吸附Sh ;将吸附了粗提样II的HZ-20ss色谱层析树脂进行装柱，用50mL的40wt%甲醇溶液以6BV/h的流速冲洗柱子；再用120mL的80wt%甲醇溶液以3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；将洗脱液于42°C旋转蒸发仪蒸干，用500 μ L的超纯水溶解，得粗提样III，置于4°C保存；
[0063](8)半制备型高效液相色谱仪收集:将粗提样III使用半制备型高效液相色谱仪按峰收集纯化:色谱柱为ZORBAX SB-C18，检测波长为220nm，进样量为100 μ L ;流动相A为0.08wt%三氟乙酸的水溶液；流动相B为10wt %乙腈与0.08wt%三氟乙酸水溶液的混合液，100wt%乙腈与0.08wt%三氟乙酸水溶液的体积比为80:20 ;洗脱条件:流动相流速0.7mL/min ;梯度洗脱流程:流动相A与流动相B初始体积比为50:50，在0.01_30min内，体积比等梯度变化为13:87。
[0064]实施例2
[0065](I)将中国典型培养物保藏中心(CCTCC N0.M 2010237)的解淀粉芽孢杆菌Q-426依次经过活化、一级种子发酵、发酵培养得发酵液；
[0066](2)酸沉淀:将发酵液10mL离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至3.0进行酸沉淀，离心(6000rpm，15min)去除上清液得沉淀；
[0067](3)清洗:使用20mL pH为1.8的超纯水清洗步骤⑴所得沉淀，清洗2次；
[0068](4)抽提:使用40mL 100wt%甲醇重悬步骤⑵清洗后的沉淀，摇床震荡3h，离心(12000rpm,5min)留上清液，将沉淀以100wt%甲醇重复震荡3次，合并3次抽提后离心的上清液；
[0069](5)浓缩:将步骤(3)所得上清液使用旋转蒸发仪浓缩至10mL，温度为42°C，得粗提样I，置于4°C保存；
[0070](6)阳离子交换树脂吸附杂质:向10mLHD-8阳离子交换树脂的层析柱中加入500 μ L的粗提样I，用50wt%的甲醇溶液以3BV/h的流速冲洗层析柱；冲洗过程中，当层析柱流出端出现白色浑浊状流出液时开始收集，当流出液变透明时停止收集与冲洗；将收集的白色浑浊流出液于42 V旋转蒸发仪中去除甲醇；取出旋转蒸发仪中的浓缩液，调pH至
3.0,离心(12000rpm，5min)去除上清液留沉淀，将沉淀用500 μ L超纯水溶解，得粗提样II，置于4°C保存；
[0071](7)色谱层析树脂吸附与解吸:向1mL HZ_20ss色谱层析树脂中加入500 μ L粗提样II，4°C，10rpm静态吸附Sh ;将吸附了粗提样II的HZ-20ss色谱层析树脂进行装柱，用50mL的60wt%甲醇溶液以6BV/h的流速冲洗柱子；再用120mL的10wt %甲醇溶液以3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；将洗脱液于42°C旋转蒸发仪蒸干，用500 μ L的超纯水溶解，得粗提样III，置于4°C保存；
[0072](8)半制备型高效液相色谱仪收集:将粗提样III使用半制备型高效液相色谱仪按峰收集纯化:色谱柱为ZORBAX SB-C18，检测波长为220nm，进样量为100 μ L ;流动相A为0.08wt%三氟乙酸的水溶液；流动相B为10wt %乙腈与0.08wt%三氟乙酸水溶液的混合液，100wt%乙腈与0.08wt%三氟乙酸水溶液的体积比为80:20 ;洗脱条件:流动相流速
0.7mL/min ;梯度洗脱流程:流动相A与流动相B初始体积比为50:50，在0.01_30min内，体积比等梯度变化为13:87。
[0073]实施例3
[0074](I)将中国典型培养物保藏中心(CCTCC N0.M 2010237)的解淀粉芽孢杆菌Q-426依次经过活化、一级种子发酵、发酵培养得发酵液；
[0075](2)酸沉淀:将发酵液10mL离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.0进行酸沉淀，离心(6000rpm，15min)去除上清液得沉淀；
[0076](3)清洗:使用20mL pH为1.8的超纯水清洗步骤⑴所得沉淀，清洗2次；
[0077](4)抽提:使用40mL 100wt%甲醇重悬步骤⑵清洗后的沉淀，摇床震荡3h，离心(12000rpm,5min)留上清液，将沉淀以100wt%甲醇重复震荡3次，合并3次抽提后离心的上清液；
[0078](5)浓缩:将步骤(3)所得上清液使用旋转蒸发仪浓缩至10mL，温度为42°C，得粗提样I，置于4°C保存；
[0079](6)阳离子交换树脂吸附杂质:向10mLHD-8阳离子交换树脂的层析柱中加入500 μ L的粗提样I，用50wt%的甲醇溶液以3BV/h的流速冲洗层析柱；冲洗过程中，当层析柱流出端出现白色浑浊状流出液时开始收集，当流出液变透明时停止收集与冲洗；将收集的白色浑浊流出液于42 V旋转蒸发仪中去除甲醇；取出旋转蒸发仪中的浓缩液，调pH至
2.0，离心(12000rpm，5min)去除上清液留沉淀，将沉淀用500 μ L超纯水溶解，得粗提样II，置于4°C保存；
[0080](7)色谱层析树脂吸附与解吸:向10mL HZ_20ss色谱层析树脂中加入500 μ L粗提样II，4°C，lOOrpm静态吸附8h ;将吸附了粗提样II的HZ-20ss色谱层析树脂进行装柱，用50mL的50wt%甲醇溶液以6BV/h的流速冲洗柱子；再用120mL的90wt%甲醇溶液以3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；将洗脱液于42°C旋转蒸发仪蒸干，用500 μ L的超纯水溶解，得粗提样III，置于4°C保存；
[0081](8)半制备型高效液相色谱仪收集:将粗提样III使用半制备型高效液相色谱仪按峰收集纯化:色谱柱为ZORBAX SB-C18，检测波长为220nm，进样量为100 μ L ;流动相Α为0.08wt%三氟乙酸的水溶液；流动相B为100wt%乙腈与0.08wt%三氟乙酸水溶液的混合液，100wt%乙腈与0.08wt%三氟乙酸水溶液的体积比为80:20 ;洗脱条件:流动相流速0.7mL/min ;梯度洗脱流程:流动相A与流动相B初始体积比为50:50，在0.01_30min内，体积比等梯度变化为13:87。
[0082]组分a-g 的保留时间分别为 11.2-12.3min、13.3-14.6min、16.3-18.2min、19.3-20.4min、25.1-26.2min、26.9-28.4min、29.1-30.0min，按出峰时间收集各个组分；检测粗提样1、粗提样III及各组分的纯度，结果如图1-9，得到7种单一组分的脂肽a、b、c、d、e、f、g 每种脂肽的纯度分别达 94.6%、97.9%、92.6%、84.8%、82.9%、93.4%、87.1%,各组分产率分别为脂肽a(C13iturin A) 23.65 %,脂肽b (C14iturin A) 36.29 %,脂肽c (C15bacillomycin D) 12.21 % ,脂肽 d (C16bacillomycin D) 9.80% ,脂肽 e (C16fengycinA) 8.25% ,脂肽 f(C17fengycin A) 7.79% ,脂肽 g(C17fengycin B) 2.00% 0
[0083]采用本发明提供的分离方法，包括前期解淀粉芽孢杆菌的发酵培养，以及所有的分离过程得到单一组分的脂肽，全过程约用5天时间，相对传统分离方法7-10天，缩短了分离周期，且能够获得单一组分，且纯度、收率均较高。
【主权项】
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) Q-426，其特征在于，保藏编号为 CCTCC N0.Μ 2010237ο2.一种如权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Q-426脂肽的分离方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)发酵培养:解淀粉芽孢杆菌经活化、一级种子培养、发酵后，得发酵液； (2)酸沉淀:发酵液离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.0-3.0进行酸沉淀，离心得沉淀； (3)清洗:使用超纯水清洗步骤(2)所得沉淀； (4)抽提:使用100wt%甲醇重悬步骤(3)清洗后的沉淀，离心留上清液； (5)浓缩:将步骤(4)所得上清液浓缩，得粗提样I; (6)吸附:向阳离子交换树脂的层析柱中加入粗提样I，用50wt%甲醇溶液洗脱；将流出液蒸发去除甲醇，调pH至2.0-3.0，离心去除上清液留沉淀，将沉淀用超纯水溶解，得粗提样II ； (7)吸附与解吸:向色谱层析树脂中加入粗提样II，静态吸附7-10h;将吸附了粗提样II的色谱层析树脂进行装柱，用40-60被％甲醇溶液洗脱后；再用80-100wt%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液蒸干后，用超纯水溶解，得粗提样III ; (8)半制备型高效液相色谱仪收集:将粗提样III使用半制备型高效液相色谱按峰收集纯化，从而实现脂肽的分离。3.如权利要求2所述分离方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)发酵培养:解淀粉芽孢杆菌经活化、一级种子培养、发酵后，得发酵液； (2)酸沉淀:发酵液离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.0进行酸沉淀，离心得沉淀； (3)清洗:使用超纯水清洗步骤(2)所得沉淀； (4)抽提:使用100wt%甲醇重悬步骤(3)清洗后的沉淀，离心留上清液； (5)浓缩:将步骤(4)所得上清液于42°C蒸发浓缩，得粗提样I; (6)吸附:向阳离子交换树脂的层析柱中加入粗提样I，用50wt%的甲醇溶液以3BV/h的流速冲洗树脂；将流出液蒸发去除甲醇，调pH至2.0，离心去除上清液留沉淀，将沉淀用超纯水溶解，得粗提样II ; (7)吸附与解吸:向色谱层析树脂中加入粗提样II，置于4°C，lOOrpm静态吸附8h;将吸附了粗提样II的色谱层析树脂进行装柱，用50wt%甲醇溶液以6BV/h的流速洗脱；再用90wt%甲醇溶液以3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；将洗脱液蒸干后，用超纯水溶解，得粗提样III ; (8)半制备型高效液相色谱仪收集:将粗提样III使用半制备型高效液相色谱按峰收集纯化，色谱柱为C18，检测波长为220nm,从而实现脂肽的分离。
【专利摘要】本发明涉及微生物代谢产物技术领域，具体为一种解淀粉芽孢杆菌Q-426及其脂肽的分离方法，解淀粉芽孢杆菌Q-426易培养，对营养要求不高，在很宽的温度及pH值范围内均能很好地生长，具有广谱的抗真菌活性，对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用；脂肽的分离方法主要包括：发酵培养、酸沉淀、清洗、抽提、浓缩、阳离子交换树脂吸附、色谱层析树脂吸附与解吸、半制备型高效液相色谱仪收集八个步骤。本发明构建了一套多种脂肽组分同步分离的方法，该方法较以前的活性炭吸附法、大孔树脂吸附法及柱层析法有着明显的优点，能够获得单一组分，且纯度、收率均较高，纯化所需时间明显缩短。CCTCC NO:M201023720100917
【IPC分类】C07K1/30, C12N1/20, C07K1/16, C12R1/07, C07K1/18
【公开号】CN105331562
【申请号】CN201510873816
【发明人】权春善, 金黎明, 郑维, 周伟, 刘静, 范圣第
【申请人】大连民族大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月2日