的核酸探针产生静 电吸附作用，使单链核酸分子（带许多负电荷）带上一个正电荷部分，从而在核酸杂交过程 中同步吸附到固相支持物的表面。由于碱性磷酸酶标记链霉亲和素也带有正电荷，这样就 避免了碱性磷酸酶非特异性吸附到固相支持物的表面。此外，所述阳离子型聚合物可以使 得碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中形成均匀悬液，使得杂交反应完成以后标记在核 酸偶联物上的碱性磷酸酶保持活性状态，从而使得碱性磷酸酶构象的平衡转换朝着天然状 态移动。
[0024] 在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可以包括杂交促进剂，所述杂交促进剂在 本质上是本领域技术人员所已知的，可作为本发明所述杂交促进剂的实例包括但不限于： 硫酸葡聚糖、聚乙二醇、酚或硫氰酸胍。
[0025] 在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可以包括其他成分，可以列举的杂交液中 其他成分的实例包括但不限于：氯化钠、杂交缓冲溶液、Denhardt's溶液、十二烷基肌氨 酸钠或十二烷基磺酸钠。可以用于本发明所述杂交缓冲溶液的实例包括但不限于：柠檬 酸-柠檬酸钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液。
[0026] 在本发明的试剂盒中，所述杂交液不包括乙二胺四乙酸盐、无机磷酸盐和乙醇胺。
[0027] 根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂包括用于扩增K-ras基因的引 物对；其中，
[0028] 用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQID N0:1所示，5'端生物素标记；
[0029] 用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQID N0 :2所示。
[0030] 在本发明的试剂盒中，上述引物对对K-ras基因高度保守，能够高度特异地扩增 K-ras基因的一段包括外显子2中第12、13密码子热点突变区在内的片段，用于下一步与金 属膜上探针的反应。扩增长度约l〇〇bp左右，与更长的扩增片段相比，短片段具有更高的杂 女效率，有利于提商一步反应的灵敏度。。
[0031] 根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂包括用于扩增K-ras基因的引 物对；其中，
[0032] 用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQID N0 :3所示，5'端生物素标记；
[0033] 用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQID N0 :4所示。
[0034] 在本发明的试剂盒中，上述引物对同样对K-ras基因高度保守，能够高度特异地 扩增K-ras基因的一段包括外显子2中第12、13密码子热点突变区在内的片段，用于下一 步与金属膜上探针的反应。扩增长度约l〇〇bp左右，与更长的扩增片段相比，短片段具有更 商的杂女效率，有利于提商一步反应的灵敏度。
[0035] 根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂还包括TaqDNA聚合酶、 4xdNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、缓冲溶液剂、镁离子及其他必要成分。其中，所述缓冲 溶液可以是10~50mmol/LTris-HCl缓冲溶液，镁离子的浓度为1. 5mM~2. 5mM，优选浓度 是 2mM。
[0036] 根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针选自长度为15~40个碱基的寡核 苷酸探针，优选选自长度为15~25个碱基的寡核苷酸探针。特别优选的核酸探针的长度 包括 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个碱基。
[0037] 本发明的试剂盒通过调整核酸探针的长度和组成，降低了核酸探针与生物素标记 靶核酸杂交的温度，从而使得杂交反应与酶联反应能够统一成一个反应过程进行。本发明 的发明人经过大量实验发现，所述核酸探针选自长度为15~40个碱基的寡核苷酸探针时 比较合适，优选选自长度为15~25个碱基的寡核苷酸探针，此时杂交反应的温度可以为 37 ~42。。。
[0038] 在本发明的试剂盒中，核酸探针长度的选择的依据是：如果核酸探针长度过低，虽 然可以提高探针杂交的特异性，但是会显著降低探针杂交的灵敏度；如果核酸探针长度过 长，可以进一步提高探针杂交的灵敏度，但探针杂交特异性会显著降低。对于过长的核酸探 针，也不能够通过提高杂交温度来提高探针杂交的特异性，因为过高的温度会使得杂交体 系中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素失活。综合上面各种因素，同时考虑到探针的GC含量对 杂交Tm值得影响，15~25个碱基的寡核苷酸探针是优选的。
[0039] 根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针还包括阳性对照探针，其序列可以 如SEQIDN0:16所示。本发明的阳性对照探针可以来自人体Actin基因序列，其不仅能 够高度特异地检测样本中的人体基因组的存在，而且能够用于质控临床样本核酸的提取质 量，并质控整个检测反应过程的正常进行。
[0040] 根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针还包括阴性对照探针，其序列可以 如SEQIDN0 :17所示。本发明的阴性对照探针可以来自引物设计软件随机生成的一段序 列，其特点是不与任何生物的核酸序列相似，其能够起到很好的阴性对照作用，质控检测反 应的特异性。
[0041] 根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针包括：
[0042] 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G>A突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :7 所示；
[0043] 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G>T突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :8 所示；
[0044] 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G>C突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :9 所示；
[0045] 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G>A突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :10 所示；
[0046] 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G>T突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :11 所示；
[0047] 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G>C突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :12 所示；
[0048] 用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上37G>C突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :13 所示；
[0049] 用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上38G>A突变的核酸探针，其序列 如SEQIDN0 :14 所示；
[0050] 用于检测K-ras基因34、35、37和38位点野生型的核酸探针，其序列如SEQIDN0 : 15所示。
[0051] 本发明的核酸探针用于检测K-ras基因的单核苷酸多态性（SNP)，也就是K-ras基 因中发生的单碱基突变，因此更优选长度为15~16个碱基的寡核苷酸探针，这个长度的寡 核苷酸探针对靶核酸中的单碱基的变异具有较高的分辨力。对初步设计的备选探针做了大 量的筛选验证工作后，获得了高度特异、分辨力高而且灵敏度相对较高的一批突变检测探 针，即分别检测34G>A、34G>T、34G>C、35G>A、35G>T、35G>C、37G>C和38G> A突变的探针序列，SEQ ID吣：7、8、9、10、11、12、13、14、和15。
[0052] 在本发明的试剂盒中，用于检测K-ras基因34、35、37和38位点野生型的核酸探 针的作用是检测样本中人体正常组织没有发生K-ras基因外显子2中第12、13密码子突变 的情况，同时作为突变型检测探针检测过程的质控。
[0053] 根据本发明的一个具体实施例，所述试剂盒还包括预处理液、后处理液和显色试 剂。
[0054] 本发明的试剂盒通过预处理液和后处理液对一步反应前后的金属膜表面进行协 同配合处理，进一步提高了金属膜表面检测K-ras基因突变的特异性，有效避免了检测结 果的假阳性。显色试剂使得金属膜表面能够顺利实现酶联显色。
[0055] 根据本发明的一个具体实施例，所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异 构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C17~C19脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构醇选自Q。~ C13异构醇。
[0056] 根据本发明的一个具体实施例，在所述预处理液中，胱胺为3~20重量份，脂肪醇 聚氧乙烯醚为2~18重量份以及异构醇为0. 2~9重量份；优选地,胱胺为5~10重量 份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3~12重量份以及异构醇为2~8重量份。
[0057] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的试剂盒中，胱胺与 脂肪醇聚氧乙烯醚在预处理液中协同配合作用，不仅能够有效封闭金属膜表面的非特异性 活性位点，提高检测的特异性，而且能够在金属膜表面形成一层保护层，有效防止使用中的 金属膜表面被氧化。
[0058] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的试剂盒中，高碳原 子数的异构醇一方面可以提高胱胺的溶解性，使其获得较高的增容参数与分子自组装活性 能力；其另一方面可以提高胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在固相支持物表面的吸附效果。
[0059] 根据本发明的一个具体实施例，所述后处理液包括Cs~C1S烷基葡萄糖苷，优选 C9~C13烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0. 5~5% (w/v)，优选1~4% (w/v)〇
[0060] 根据本发明的一个具体实施例，所述后处理液的PH为9. 0~10. 0。
[0061] 本发明的试剂盒利用后处理液对一步反应完成后的固相支持物表面进行洗涤是 非常重要的，一方面可以将未与靶核酸杂交的以及非特异性杂交的生物素标记核酸探针分 子从固相支持物表面洗去，并将特异性杂交体保留在固相支持物表面；另一方面能够保持 碱性磷酸酶的活性，可以保证显色的效率，背景反差对比更好。
[0062] 根据本发明的一个具体实施例，所述后处理是指利用后处理液对所述金属膜表面 洗涤3~5次。
[0063] 根据本发明的一个具体实施例，所述金属膜选自