照品为经过标定的已知 浓度的假病毒，其浓度为1. 00~5. 00E+05copie/ml。
[0029] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述CA16/EV71阴性对照：品为经过灭菌处理 的生理盐水。
[0030] 使用上述的检测试剂盒用于检测样本中CA16/EV71-RNA的方法，包括如下步骤：
[003。 （1)试剂准备；
[0032] 按照提取试剂I200μ1~1ml/人份，CA16/EV71-内标1μ1/人份的比例，取相 应量的RNA提取溶液I及CA16/EV71-内标，充分混匀得提取溶液1-mix，瞬时离屯、后备用；
[0033] 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液38μ1/人份，CA16/ EV71-酶混合液2μ1/人份的比例，取相应量的PCR反应液及CA16/EV71-酶混合液，充分混 匀，得PCR-mix，瞬时离屯、后备用；
[0034] 似RNA提取：磁珠法提取I-RNA;
[0035] SOI裂解病毒：每个离屯、管中加入100μ1~1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入 100μ1~1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离屯、后备用；
[0036] S02磁珠吸附核酸：在步骤SO1瞬时离屯、后备用的溶液中加入30μ1~400μ1 RNA提取溶液II，震荡混匀，室溫静置10~30分钟；
[0037] S03去除杂质：静止结束瞬时离屯、后，将离屯、管置于磁珠分离器上，2~5分钟后缓 慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；
[003引 S04洗涂：在步骤S03保留备用的磁珠内加入200μ1~1mlRNA提取溶液III和 100μ1~400μ1RNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离屯、后将离屯、管再次置于分离器上；
[0039] S05去除废液：静止，上清液分为两层，将吸头插入离屯、管底部，从底部开始缓慢 将液体完全吸出丢弃，静置，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠备用；
[0040] S06洗脱核酸：在步骤S05保留备用的磁珠中加入10μ1~100μ1RNA洗脱液， 将离屯、管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，室溫静置5~30分钟后将离屯、管再次置于分离 器上2~5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1. 5ml灭菌离屯、管中；
[00川 S07根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μIPCR-mix， 并吸取步骤S06的新的灭菌离屯、管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各10μ1加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；
[0042] (3)巧光PCR反应：采用实时巧光定量PCR技术，WCA16、EV71病毒蛋白外壳VP1 基因为扩增祀目标，使用所述试剂盒，在实时巧光PCR仪上通过PCR扩增对待测样品中CA16/EV71-RNA进行定性检测；
[0043] (4)结果分析：选择FAM通道（Repo;rtere:FAM,如enche;r:None)检测CAIG; 选择肥X或VIC通道〇teporter:VIC，如encher:None)检测EV71 ;选择R0X通道 巧巧orteriRO)(，如enchermone)检测内标；利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动 调苄基线的开始值、结束值W及阔值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本 Ct值大小，判断检测结果。
[0044] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[004引 （1)本发明在对CA16、EV71所有已知基因型的序列进行比对的基础上，W柯萨奇 病毒A16型和肠道病毒71型衣壳蛋白基因为检测祀区，设计特异性引物和特异性巧光探 针，获得了在同一管反应液中同时检测2种肠道病毒的反应体系；
[0046] (2)同时，对肠道病毒RNA的提取方法进行了优化，选择了吸附效果好、易于纯化 的磁珠法提取RNA，可W获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳 定性，检测灵敏度可达400copie/ml，检测范围为4. 0E+02~4. 0E+08copies/ml;
[0047] 做设置了内标监控系统，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取 和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止检测结果出现假阴性谋光PCR扩增结束后， 经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可为灵敏、早期诊断柯萨奇病毒A16型和肠道病毒 71型感染提供可靠的实验证据。
【附图说明】
[0048] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附图获 得其他的附图。
[0049] 图1.本发明实施例提供的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检测 试剂盒对CA16/EV71近似病原体的检测（目标通道）；
[0050] 图2.本发明实施例提供的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检测 试剂盒对CA16/EV71近似病原体的检测（内标通道）；
[0051] 图3.本发明实施例提供的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检测 试剂盒对CA16梯度样本检测（CA16通道）；
[0052] 图4.本发明实施例提供的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检测 试剂盒对EV71梯度样本检测巧V71通道）；
[0053] 图5.本发明实施例提供的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检测 试剂盒中CA16参考品扩增曲线；
[0054] 图6.本发明实施例提供的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检测 试剂盒中EV71参考品扩增曲线。
【具体实施方式】
[0055] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0056] 实施例1
[0057] 本实施例提供的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检测试剂盒，包 括W下各组分：RNA提取溶液，RNA洗脱液，内标，PCR反应液，CA16/EV71酶混合液，CA16/ EV71阳性对照品，CA16\EV71阴性对照品，用于祀多核巧酸扩增的上下游引物CA16-F、 EV71-F与CA16-R、EV71-R，用于祀多核巧酸检测的探针CA16-P、EV71-P，用于检测内标的上 下游引物IC-F与IC-R，用于检测内标的探针IC-P。
[0058] 所述内标为插入PUC18T载体的一段长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组 体，其浓度为1. 00E+03copies/ml~1. 00E+06copies/ml;所述90碱基对的序列为：
[0059] 日'-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCA CTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3' 。
[0060] 所述RNA提取溶液包括如下组分：
[0061] RNA提取溶液I:十二烷基硫酸钢，质量/体积0. 3 %~1. 2 %、曲拉通，体积/体积 1. 0 % ~5. 0 %，异硫氯酸脈 0.Imol/L~1. 2mol/l、50μg/ml~350μg/ml的磁珠；
[0062] RNA提取溶液II:4-径乙基赃嗦乙横酸150mmol/L~350mmol/l、抑6. 5 + 0. 2,氯 化钢 150mmol/L~400mmol/L;
[0063] RNA提取溶液III:曲拉通，体积/体积0. 5 %~3. 0 %、氯化钢lOOmmol/L~ 400mmol/L；
[0064] RNA提取溶液IV:矿物油。
[0065] 所述RNA洗脱液为Tris-HClO. 5mol/L~1. 5mol/l、邸了40. 2mol/L~1. 5mol/L。
[0066] 所述PCR反应液为5XPCR反应缓冲液10yl，2mmol/L脱氧核糖核巧Ξ憐酸， 0. 1ymol/L~0. 5ymol/L用于祀多核巧酸扩增的上下游引物CA16-F、EV71-F与CA16-R、 EV71-R，0.