1。
[0072] 链霉亲和素包被的磁球与生物素修饰的适配体相结合，蔗糖酶和互补DNA相结 合；将DNA-鹿糖酶聚合物通过互补DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面；当 溶液中含有所需检测目标分子时，目标分子与适配体特异性结合，从而将DNA-蔗糖酶聚合 物从磁球上释放到溶液中；用磁分离器分离溶液，释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够 高效水解鹿糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-鹿糖 酶的量能够通过葡萄糖的量来表示，并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比 例关系。因此，血糖仪的读数能够被用来定量目标分子的浓度。
[0073] 2. 2缓冲液中的赭曲霉毒素 A的检测
[0074] 如图2所示，室温条件下，随着缓冲液中OTA浓度的增加，血糖仪的读数显著增加， 缓冲液中OTA的浓度在I X 10 8M~4X 10 6M时，血糖仪的读数与OTA的浓度存在一个良好 的线性关系。回归方程可以表示如下：y = 〇. 4412x+0. 1411，R2= 0. 9924。其中X表示OTA 的浓度；y表示血糖仪的示数，R是回归系数。最低检出限为6. 7 X 10 9M(2. 69 μ g/kg)。
[0075] 中国所采用的GB 2715-2005《粮食卫生标准》中谷类和豆类中赭曲霉毒素 A的最 高限量为5 μ g/kg，CAC(国际食品法典委员会）中规定的小麦、大麦、黑麦中的赭曲霉毒素 A的最高限量为5 μ g/kg，EC (欧盟委员会）中规定的速溶咖啡和葡萄干中赭曲霉毒素 A的 最尚限量为10 y g/kg，婴幼儿食品中赫曲霉毒素 A的最尚限量为0. 5 μ g/kg。因此，本发明 所开发的适配体生物传感的检出限除了婴幼儿食品基本能满足检测要求。
[0076] 实验设定OTA浓度为12. 5 μ M时，进行5次重复实验，相对标准偏差为1. 5%，表明 本发明所开发的方法有良好的再现性。
[0077] 2. 3特异性分析
[0078] 为了研究所开发的生物传感器的特异性，选择了 4种毒素 （AFBp AFGp AFMp ΖΕΑ) 作为干扰因子。结果如图3所示，对照组与AFB^ AFG^ AFM^ ZEA、MIXl组的血糖仪读数基 本一致，明显低于OTA组的血糖仪读数；ΜΙΧ2组的血糖仪读数略低于OTA组，说明其他毒素 分子不能和OTA的适配体特异性结合，几种毒素分子混合存在可能会影响OTA与其适配体 的特异性结合，从而导致ΜΙΧ2组的血糖仪读数略低于OTA组。实验结果表明，OTA适配体 能特异性识别OTA分子，不与其他干扰因子结合，说明合成的适配体生物传感器具有很好 的特异性。
[0079] 实施例2适配体生物传感器的合成
[0080] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0081] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0082] 取 300 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer Β)与 0· 5mg sulfo-SMCC混合，祸旋震荡 5min， 放置恒温混匀仪上，室温反应lh。
[0083] I. I. 2DNA分子的活化
[0084] 取 80 μ 1 100 μ M 互补 DNA (thiol-DNA，5 ' -CCCACACCCGATCAAAAAAAAAAAA-SH-3 '）， 1 μ I 0.1 M buffer B，1 μ 130mM TCEP (超纯水）加入到I. 5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒 温混匀仪上，室温反应0. 5h。
[0085] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0086] 将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分别加入到超滤管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，离心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪 上反应24h。
[0087] I. 2DNA-鹿糖酶在磁球上的固定
[0088] I. 2. 1 磁球和 OTA aptamer 的链接
[0089] 取0. 5ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球（MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除 上清液，用 buffer B 洗涤 2 次；取 40 μ 1 0· ImM OTA aptamer (5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAA AGGGAGCATCGGAAAAAAAAA AAA-biotin-3'）（超纯水）加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放 置恒温混匀仪上，室温反应lh，用buffer B洗涤3次。
[0090] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗涤
[0091] 将反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)离心， 用buffer A洗涤8次。
[0092] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0093] 将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置 恒温混匀仪上，室温反应lh，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物 (Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成的适配体生物传感器系统。
[0094] 实施例3适配体生物传感器的合成
[0095] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0096] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0097] 取 500 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)与 2mg sulfo-SMCC 混合，祸旋震荡 5min， 放置恒温混匀仪上，室温反应3h。
[0098] 1 · 1 · 2DNA分子的活化
[0099] 取 120 μ 1 100 μΜ S#DNA(thiol-DNA，5'-CCCACACCCGATCAAAAAAAAAAAA-SH-3'），3yl (λ IM buffer B，3yl30mM TCEP(超纯水）加入到L5ml离心管中，涡旋混匀， 放置恒温混匀仪上，室温反应2h。
[0100] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0101] 将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分别加入到超滤管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，离心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪 上反应60h。
[0102] I. 2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0103] I. 2. 1 磁球和 OTA aptamer 的链接
[0104] 取2ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球（MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上 清液，用 buffer B 洗涤 2 次；取 80 μ 1 0· ImM OTA aptamer (5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAG GGAGCATCGGAAAAAAAAA AAA-biotin-3'）（超纯水）加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放置 恒温混匀仪上，室温反应2h，用buffer B洗涤3次。
[0105] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗涤
[0106] 将反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)离心， 用buffer A洗涤8次。
[0107] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0108] 将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置 恒温混匀仪上，室温反应3h，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物 (Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成的适配体生物传感器系统。
[0109] 实验例1适配体生物传感器反应条件的优化
[0110] 1、实验方法
[0111] 1.1孵育时间的优化
[0112] 孵育时间对于实验是一个重要的因素，因此对其进行了优化。将实施例1开发的 适配体生物传感器分别与含有50和100 μ M的赭曲霉毒素 A的溶液反应，分别在孵育0、5、 15、30、60、IOOmin的时候进行磁性分离。然后吸取10 μ 1上清液，加入到5 μ I 2Μ蔗糖溶液 (buffer Β)离心管中，涡旋混匀，室温反应30min。取5μ1反应后溶液用血糖仪检测。
[0113] I. 2反应时间的优化
[0114] 实验对传感器与目标分子反应从而释放出的蔗糖酶与蔗糖的反应时间进行了优 化。将实施例1开发的适配体生物传感器分别与含有50和100 μ M的赭曲霉毒素 A的 溶液反应，Ih以后利用磁分离器进行磁性分离，然后吸取10 μ 1上清液，加入到5 μ 1 2Μ Sucrose (buffer Β)离心管中，祸旋混勾，室温条件下，分别在反应0、5、15、30、45min时候， 吸取5 μ1反应后溶液用血糖仪检测。
[0115] 1. 3适配体传感器存储时间的研究
[0116] 为了适配体生物传感器能够更好的被开发利用，对其存储时间进行了研究。实验 设定OTA浓度为12. 5 μ M时，将实施例1合成的适配体生物传感器系统在4°C条件下，分别 保存ld、3d、7d、10d，然后按照上述的实验步骤与蔗糖溶液反应，通过血糖仪进行检测。
[0117] 2、实验结果
[0118] 2.1孵育时间的选择
[0119] 结果如图4所示，室温条件下，选择50 μ M和100 μ M的OTA溶液与合成的适配体 生物传感器系统结合，相隔不同的时间采用磁分离器分离，取上清液与蔗糖溶液反应，运用 血糖仪进行检测。当孵育时间在5min时，血糖仪读数迅速增加，当孵育时间达到60min时， 血糖仪读数基本稳定。如图4中结果显示，传感器与OTA分子的孵育时间在60min时，蔗糖 酶已经基本全部释放，为了保证蔗糖酶完全释放，选择60min作为孵育时间。
[0120] 2. 2反应时间的选择
[0121] 如图5所示，室温条件下，选择50 μΜ和100 μΜ的OTA溶液与合成的适配体生物 传感器系统结合