，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0034] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
[0035] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所 列项目的任意的和所有的组合。
[0036] 实施例1PML基因和RARA基因检测探针的制备
[0037] 本实施所述PML/RARA检测探针的制备方法，包括以下步骤：挑选包含目的基因 PML和RARA及两端序列的克隆，如图1和2所示。GSPPML包括第一探针、第二探针、第三探 针和第四探针，具体如下表，其购买于InvitrogenRPllBAC及CTDBAC克隆库。GSPRARA包 括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针和第五探针，具体如下表，其购买于Invitrogen RP11BAC及CTDBAC克隆库。
[0038] 以下分两组检测探针分别制备。
[0039]PML
[0040]
[0043] (2)基因探针的制备：使用Qiagen公司的PlasmidMaxiKit，按照说明书要求的 操作方法对不同BAC克隆分别进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的 吸光度对质粒DNA定量；采用高压灭菌的超纯水稀释为200ng/ul，采用1. 5ml的离心管分 装，最后分别将得到针对PML基因或RARA基因的4种或5种质粒DNA混合，-20°C密封保 存。
[0044] (3)通过切口平移方法对质粒DNA混合物进行荧光标记，针对RARA基因的每 种探针标记的荧光素为Spectrum-Orange，针对PML基因的每种探针标记的荧光素为 Spectrum-GreendUTP。米用abbott的NickTranslationKit，按如下方案，严格避光条件下 在冰上配制PCR反应体系。
[0045]
[0046] 配完后震荡混匀，在16°C标记12小时，再80°C孵育10分钟灭活酶。取5ul使用 2%琼脂糖凝胶做电泳，要求在300bp左右存在弥散的带。
[0047] 对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1. 5ml离心管中依次加入醋酸钠 和无水乙醇，避光、冰上配制：
[0048] 标记产物 45ul
[0049]醋酸钠（3mol/L) 5ul
[0050] 无水乙醇 125ul
[0051] 混匀后置于_70°C冰箱中至少2小时，4°C13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿 搅动沉淀，加入lml的70 %乙醇，4°C13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉 淀，避光干燥。使用lul纯化水溶解沉淀，获得GSPPML和GSPRARA基因探针，避光、-20°C 储存。
[0052] 4.GSPPML和GSPRARA基因探针验证：使用PML探针+RARA探针制备的杂交液， 使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证（检测方法参考实施例3)。包含中期或 间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。 如图3所示：中期染色体的FISH杂交结果图。图中可以看见染色体相应位置显示红色荧光 和绿色荧光信号。GSPPML探针显示绿色信号；GSPRARA探针为红色信号。
[0053] 实施例2 :PML和RARA基因检测试剂盒制备方法
[0054]PML和RARA基因检测试剂盒包括有PML和RARA杂交液和DAPI复染剂两个组分， 其中PML和RARA杂交液包含实施例1所述的GSPPML和GSPRARA基因探针、用于杂交环 境（促进杂交）的缓冲液组分、封闭重复序列的COTHumanDNA等。DAPI复染剂主要用于 杂交后的细胞复染，其中的DAPI会与DNA结合，使得细胞核显示出蓝色荧光，含有对苯二胺 的复染剂可以保持荧光的稳定。
[0055] 具体配方如下：
[0056] 杂交液配制
[0057]
[0059] a. DAPI复染剂配制
[0060] l〇mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，调节pH为9·0,加入9ml甘油，反复震荡混 匀，-20°C储存。取2. 5μ1的DAPI溶液（0.lmg/ml)溶于lml抗褪色液中，避光条件下反复 震荡混匀，-20 °C避光密闭保存。
[0061] b.成品组装
[0062]
[0063] 实施例3 :PML/RARA基因检测试剂盒的检测方法
[0064] 1、样品处理
[0065] 1. 1取外周血或骨髓2~3ml(肝素钠抗凝）2000rpm离心5min，小心去上清。
[0066] 1. 2加入10ml的低渗液（0·075mol/L KC1)，吹打混匀，静置3min。
[0067] 1.3 37±1°C水浴箱低渗30min。
[0068] 1. 4加新鲜固定液1ml，吹打混勾，室温预固定lOmin。
[0069] 1. 5吹打混勾，2000rpm离心5min。
[0070] 1.6去上清，沉淀加新鲜固定液5~10ml，吹打混勾，室温静置lOmin。
[0071] 1. 7 2000rpm离心5min，去上清。
[0072] 1.8可重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀洗白洗干净（此步骤不需室温静置 lOmin)〇
[0073] 2、制片
[0074] 2· 1取一张干净的载玻片；
[0075] 2. 2重悬细胞后取3μ1悬液滴加到载玻片上；
[0076] 2. 3室温下晾干；
[0077] 2.4用10Χ物镜在相差显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞 数量在1〇〇~200个为宜。
[0078]a)如果细胞密度及数目合适，继续步骤3;
[0079]b)如果细胞有重叠，则加入适量新鲜固定液稀释细胞悬液，混匀后另取3μ1悬液 制片，
[0080]C)如果细胞密度低，则2000rpm离心5min，小心吸去适量上清液，混匀后另取3μ1 悬液制片，晾干，观察；
[0081] 2. 5在相差显微镜下观察，如果细胞碎片太多，则需要做预处理并且选择合适的杂 交区域；
[0082]注意：每个病例至少需要多制一张片，细胞滴片可置于放有无水乙醇的密闭容器 中，在-20±5°C可以保存一年。剩余的细胞悬液可以在2~8°C保存一个月，以便必要时重 新制片。
[0083] 3、玻片预处理
[0084] 3. 1将滴好的玻片置于室温2XSSC(PH7. 0)溶液中浸泡2min;
[0085] 3. 2依次在室温70%，90%，100%的乙醇中浸泡2min脱水；然后取出玻片，室温晾 干。
[0086] 4、样品和探针同时变性
[0087] 4. 1从-20°C冰箱中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；
[0088] 4. 2加10μ1的杂交液到杂交区域，迅速盖上18X18mm盖玻片，轻压使杂交液均匀 分布，避免产生气泡；
[0089] 4. 3用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位；
[0090] 4. 4将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设 置"Denat&Hyb"程序，变性78°C2分钟，杂交37°C10~18小时（若无杂交仪，可使用替代 仪器，如恒温热台进行变性，电热烘箱/或水浴锅进行杂交，需注意温度准确及保持杂交湿 度）。
[0091] 5、杂交后洗涤及复染
[0092] 5. 1洗涤前30分钟，将配制好的洗液I放入72 ± 1 °C水浴中，洗液11室温放置；
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