] 图1为具有较大张力的小环形核巧酸探针结构及检测原理图。
[0016] 图2为修饰巧光报告基团密封环DNA单链合成路线图（i : Ξ乙胺，溶剂DMS0/出0，室 溫（18~25°C)，化；ii:溶剂出0，室溫（18~化。C)，比）。
[0017] 图3为RP检测完全互补和单碱基变异结果(a: RP加入完全互补或单碱基变异DNA前 后巧光光谱(PBS 50mM，pH 7.4);b:目标DNA链浓度梯度检测(灵敏度检测)结果。
[0018] 图4为Μ和RP在室溫下分别检测完全互补和单碱基变异序列结果(a:巧光检测结 果;b:电泳分析检测杂交信号。
[0019] 图5为RP检测miR-21含量结果图（a:特异性证明，用RP检测miR-21的家族成员 (miR21，miR21a和miR2化）其中miR21a和miR2化分别与miR21单碱基错配，具有高同源性;b: 对RP分别与miR21，miR21a和miR2化的杂交的电泳分析;c:RP与miR-21检测的灵敏度实验， 误差线代表Ξ次实验结果的标准偏差）。
[0020] 图6为HeLa、MCF-7和MDA-MB-231S种细胞miR-21含量检测结果(a:用实时定量PCR 检测HeLa、MCF-7和MDA-MB-23种细胞中miR-21的相对含量;b: RP探针检测HeLa、MCF-7和 MDA-MB-231细胞中miR-21中的含量，进而成评价RP的特异性，标尺是2μπι)。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第Ξ版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 本发明所用的DNA是购自生工生物技术上海有限公司；所有的RNA是从上海吉玛制 药技术有限公司购买;所有DNAW及RNA的浓度是在260nm波长下，用1毫升的石英比色皿在 化ry 60紫外-可见分光光度计中进行检测（安捷伦科技公司，美国）。巧光测量是在一个3毫 升的石英比色皿，在室溫下使用日立F-7000巧光配备氣气灯光源进行检测。所有的光谱测 定在憐酸盐缓冲溶液（50mM，pH = 7.4)，在激发波长为480nm。水是用微孔滤膜过滤系统 (Millipore公司的纯化，Be壯orcUMA)。一个DYY-6C电泳电源和DYCZ-24D聚丙締酷胺凝胶电 泳(北京六一仪器厂)进行聚丙締酷胺凝胶电泳(PAGE)分析。该图像是由Doc凝胶EZ系统记 录（bio-rad)。细胞的巧光图像进行了成像拍照（Olympus IX 51)。脂质体2000购自 Invihogen公司（CarlsbadiCA)，根据制造商的指示使用。所有其他化学物均为分析级，并 被用作从制造商获得的。
[0023] 实施例1、具有较大张力的小环形核巧酸探针合成
[0024] R是制备RP的至关重要的环节，由于DNA是不稳定的，所W寻找一些有效的且溫和 的反应对DNA做一些修饰，其中不需要化催化的"click reaction"是非常有希望的一种反 应。通过在修饰巧光报告基团的DNA单链两端分别修饰氨基，得带修饰巧光报告基团且两端 修饰有氨基的DNA单链(简称为M)，修饰的氨基可W与特殊的活性醋反应，反应获得改性的Μ (简称为ΜΑ)，由于ΜΑ分子量大于Μ，所W在聚丙締酷胺凝胶中ΜΑ会比Μ跑得慢一些，然后将ΜΑ 与1，3-二叠氮丙烷反应，得到修饰巧光报告基团密封环DNA单链，简称为R，将获得的修饰巧 光报告基团密封环DNA单链与修饰泽灭基团的长度短于密封环DNA单链的DNA单短链(DNAQ) 进行杂交，即获得环形DNA的探针，简称为RP(图2)，合成的具体步骤如下：
[0025] (1)1，3-二叠氮丙烷合成：取1，3-二漠丙烷（8.8111111〇1)和催化量的1(1(2〇111旨)加入 50mL DMF中，然后慢慢加入(30分钟)叠氮化钢(2g，31mm);盖上侣锥纸避光然后混合物被加 热到80°C，反应20h，反应完全后将黄色液体倒在冰/水(25〇1111)中，然后用0〔1萃取^次，合 并萃取剂有机相，减压除去溶剂，在室溫下获得到产物为无色液体。
[0026] (2)MA制备:将修饰巧光报告基团且两端修饰有氨基的DNA单链(M)80°C进行退火 20min，然后降溫得到发夹结构的MA;由于Μ链两端修饰的氨基与活性醋（Carbonic acid, 11,12-didehydro-5,6-dihydrodibenzo[曰，e]cycloocten-5-yl 4-nitrophenyl ester)按 摩尔比为1:60进行反应，其中M溶解在dd出0中，活性醋溶解在二甲基亚讽(DMSO)中，反应时 d地2〇与DMS0的体积比为1:2,加入少许Ξ乙胺使Ξ乙胺与Μ的摩尔比为30:1，室溫反应化。 通过PAGE胶验证是否反应完全，反应完全后将反应液用透析盒将DMS0除去，后取出溶液得 到改性的M(MA)产物，保存于-20°C，用ESI质谱进行分子量确定，其均重分子量MW为 12999.9。
[0027] (3)R制备:将1,3-二叠氮丙烷加入MA溶液中使MA与1,3-二叠氮丙烷的摩尔比为1: 30的，室溫1小时，保存于-20°C得到R备用，采用ESI质谱进行分子量确定，其均重分子量MW 为13126.0。
[002引（4)RP制备：修饰巧光报告基团密封环DNA单链与修饰泽灭基团的DNA短单链 (DNAQ)进行杂交，即获得环形DNA探针。
[0029] 合成RP过程中也可W在密封环DNA单链上修饰泽灭基团，DNA短单链上修饰巧光报 告基团。
[0030] 本实施例的RP即可通过电泳分析，也可通过巧光检测，电泳分析是在RP与DNA或者 RNA杂交过程中采用质量分数为16%的非变性聚丙締酷胺凝胶，190V电压下电泳化，后采用 EB进行染色，最后用凝胶成像系统成像进行观测；巧光检测的缓冲溶液是PBS(50mM，pH 7.4)，激发波长是480nm，该检测条件适用于单碱基错配的检测。
[0031 ]实施例2、具有较大张力的小环形核巧酸探针进行DNA检测
[0032] 为证明实施例1合成的RP可W作为探针进行目标链检测，按照实施例1合成RP进行 0魁检测，其中1的序列为5'-畑2-旨。旨日旨/16。41(11'/旨。1:。日日。日1:。日旨1:。1旨日1日日旨。1日。。日。1:。邑。-畑2-3'，0酷〇的序列为5'-1:。日邑日。1邑日1邑1:1邑日邑。日/13册1-3'。
[0033] 同时合成目标检测链，具体序列如下：
[0034] Com完全互补：5'-1:agcttatcagactgatgttga-3'（沈Q ID NO. 1);
[00：35] lTNC:5，-1:agcttatcagactgaggttga-3,（沈Q ID N0.2);
[0036] lHNC:5，-1:agcttatgagactgatgttga-3,（沈Q ID N0.3)
[0037] 将合成的目标链分别加入含RP的PBS(50mM，pH7.4)缓冲液中，在激发波长为 480nm处进行巧光检测，结果如图3中a所示。结果显示，当目标检测链为互补DNA(COM)时，RP 巧光得到极大地恢复，然而，当目标检测链为单碱基错配DNA(1TNC和1HNC)时，RP巧光仅很 少的恢复。
[0038] 在核酸检测中探针的灵敏度也是很重要的，从而进一步探讨RP的灵敏度，分别向 RP中加入完全互补链使其终浓度为6.25nM、12.5nM、18.75nM、25nM、37.5nM的，结果如图2中 b所示。结果显示，目标检测链浓度低至6nM的仍然可W使用标准的日立F-7000巧光检测，证 明本发明的检测探针的灵敏度好。
[0039] 为了研究环形DNA探针的优越性，将Μ和RP在室溫下分别检测完全互补和单碱基变 异序列，通过巧光检测和电泳分析检测杂交信号，结果如图4所示。由图4可知，Μ组在室溫下 识别单碱基错配的DNA序列差别不大（图4中a和C)，而WRP为探针的运一组完全互补的DNA 链与单碱基错配的DNA链得到的信号有很大的区别（图4中b和d)。表明本发明所设计的RP探 针在与碱基错配的杂交时信号存在差异，并且单