探针作用后，染 料的紫外吸收发生了显著的变化。图中，在波长等于600nm处从下向上每条曲线对应的ATP 浓度为:0,5，10,20,30,40,50,60,70,80,90，100，110，120，130，140，150微摩尔每升。
[0057] (2)ATP分子荧光探针的缓冲溶液中不断加入ATP，对该探针的荧光强度进行分析。 [0058] 参见图2,图2所示的为，本发明制备的近红外荧光探针的缓冲溶液中逐渐加入ATP 后的荧光谱图；图中，横坐标为波长（wave length)，单位为nm;纵坐标为荧光强度（FL intensity)，单位为(a.u.) 〇
[0059]将ATP不断地加入到溶有近红外荧光探针的缓冲液中，探针的浓度为5微摩尔每 升，如图所示，随着ATP的不断加入，该探针的荧光强度不断增强。图中，从下向上每条曲线 对应的 ATP 浓度为：0·005,0·015,0·15,0·225,0·300,0·375,0·450,0·600,0·750,0·900， 1 · 050，1 · 250，1 · 400，1 · 550，1 · 700，1 · 850，2 · 000，2 · 200，2 · 400 毫摩尔每升。
[0060] (3)ΑΤΡ分子荧光探针的缓冲溶液中不断加入ΑΤΡ，对该探针灵敏度进行分析。
[0061]参见图3,图3为本发明制备的近红外荧光探针的荧光强度与ATP之间的线性关系 图；图中横坐标为ATP分子的浓度[ATP concentration]，单位为微摩尔每升，纵坐标为焚光 强度(FL intensity)，单位为(a.u.)，其中近红外探针的焚光强度(y)与ATP分子的浓度(X) 满足一元线性方程:y = 2.13977*x+175.0816，相关系数r = O. 98884;
[0062]将ATP加入到溶有近红外荧光探针的缓冲溶液中，探针的浓度为5μΜ，由图3可以看 出，探针的荧光强度与ATP的浓度在5μΜ到230μΜ范围内有较好的线性关系，这使得定量地检 测ATP成为可能，经过计算分析可得，ATP分子荧光探针的最低检测限(DL)为1.1816μΜ。 [0063] (4)ΑΤΡ分子荧光探针的选择性分析
[0064] 参见图4,图4本发明制备的近红外荧光探针的检测专一性的实验图，图中，横坐标 为二十中不同的干扰物质，纵坐标为近红外荧光探针的荧光强度比;干扰物质分别为：
[0065] 1:CH3C00-，2:Cr，3:C〇32-，4:F-，5:HC〇3-，6:Ν〇2-，7 :Pi，8:PPi，9:S〇42-，10:S032-，11: Cu 2+，12:Al3+，13:Ca2+，14 :Fe2+，15:Zn2+，16:GSH，17 :Ala，18:Lys，19:Leu，20:Tyr;
[0066] 先测得溶有近红外荧光探针的缓冲液的荧光强度，再将等浓度的不同阴离子、阳 离子以及蛋白质分别加入到溶有近红外荧光探针的缓冲溶液中，测得其荧光强度，后再分 别向检测体系中加入等量的ATP，测得其荧光强度，将后两次测得的荧光强度与第一次测得 的荧光强度的比值作为纵坐标值，各干扰物质作为横坐标，得图4,由图4可以看出，外加的 干扰物质对探针特异性检测ATP是没有干扰的;从而说明该近红外探针检测时，具有较好的 专一 ,性。
[0067] (5)探针对不同核苷磷酸的响应
[0068] 参见图5,图5为本发明制备的近红外荧光探针对不同的核苷磷酸的响应图，图中， 横坐标为各核苷酸的浓度，单位为微摩尔每升;纵坐标为荧光强度，单位为(a. u.);被检测 的核苷包括:ATP，ADP，AMP，CTP，GTP，TTP 与 UTP;
[0069] 将ATP溶液逐渐加入到溶有探针的缓冲液中，同时测得每次的荧光强度，以每次加 入ATP后测得的荧光强度与未加 ATP时探针的荧光强度比值作为纵坐标，以ATP的浓度为横 坐标作图，单位为微摩尔每升;ADP，AMP，CTP，GTP，TTP与UTP与探针的相互作用，按照ATP的 检测步骤操作;可以看出，该探针在核苷磷酸的浓度大于IOOyL时可以将ATP与其他核苷磷 酸区分开。
[0070] (6)探针与不同的核苷磷酸作用后颜色的变化图
[0071] 参见图6,图6为本发明制备的近红外荧光探针与不同的核苷磷酸作用后所呈现的 颜色变化图。将探针配成30yL的溶液，后分别向溶液中加入ATP、ADP、AMP、GTP、UTP、CTP、 TTP，观测颜色变化，该图中1-8号瓶中的物质分别为：1、30μΜ探针溶液8mL，2、30μΜ探针与80 μΜ的ATP的混合液8mL，3、30μΜ探针与80μΜ的ADP的混合液8mL，4、30μΜ探针与80μΜ的AMP的混 合液8mL，5、30μΜ探针与80μΜ的GTP的混合液8mL，6、30μΜ探针与80μΜ的UTP的混合液8mL，7、 30μΜ探针与80μΜ的CTP的混合液8mL，8、30μΜ探针与80μΜ的TTP的混合液8mL。
[0072] 从该图可以看出探针对不同的核苷三磷酸作用会呈现不同的颜色变化。
[0073] 综上所述，本发明的ATP分子荧光探针，具有较高的灵敏度以及较好的专一性，探 针的合成较为简单，检测样品的前处理十分简便，并且检测波长在近红外区，可以有效地避 免生物分子的自发荧的干扰。
[0074] 本发明是基于方酸菁染料(SQ)为母体的近红外染料，其可特异性地检测ATP，并且 对抗外界干扰的能力较强，灵敏度较好，同时在检测过程中，荧光强度与ATP的浓度存在一 定的线性关系，可用于ATP的定量分析;在有外界干扰物质加入时，其荧光强度不受影响，由 于该荧光探针在近红外区发光，所以存在的背景干扰较小，是较为理想的探针。
[0075]本发明所附权利要求概括了本发明的范围，在该发明的构思下，基于本发明的改 进物质，都将被该发明所涵盖。
【主权项】
1. Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于，其步骤为： 51、 将方酸菁染料溶于有机溶液中，获得方酸菁有机溶液； 52、 将Ν，Ν-二（2-氨乙基）-1，2-乙二胺溶于有机溶液中，获得Ν，Ν-二（2-氨乙基）-1，2-乙二胺有机溶液； 53、 将方酸菁有机溶液滴加到Ν，Ν-二（2-氨乙基)-1,2-乙二胺有机溶液中，在室溫环境 下揽拌2小时，然后去除有机溶液，经柱色谱分离提纯，获得Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针。2. 根据权利要求1所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于:所述有 机溶液包括二氯甲烧溶液。3. 根据权利要求1所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于:所述有 机溶液包为无水二氯甲烧。4. 根据权利要求1所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于:所述方 酸菁有机溶液的浓度为4.19mM。5. 根据权利要求1所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于:所述N， N-二(2-氨乙基)-1,2-乙二胺有机溶液的浓度为24.07mM。6. 根据权利要求1所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于:所述方 酸菁染料与N，N-二(2-氨乙基)-1,2-乙二胺的摩尔比为1:6。7. 根据权利要求1所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于:所述室 溫环境为18-25°C。8. 根据权利要求1所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特征在于:所述Ξ 憐酸腺巧近红外巧光探针的分子结构式为：9. 根据权利要求2-7中任意一项所述的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针的制备方法，其特 征在于： 51、 将250mg的方酸菁染料溶于lOOmL的无水二氯甲烧中，获得方酸菁有机溶液； 52、 将360μΙ的N，N-二（2-氨乙基）-1，2-乙二胺溶于无水二氯甲烧中，获得N，N-二（2-氨 乙基)-1，2-乙二胺有机溶液； 53、 将方酸菁有机溶液滴加到Ν，Ν-二（2-氨乙基)-1,2-乙二胺有机溶液中，在室溫环境 下剧烈揽拌2小时，然后去除无水二氯甲烧，获得近红外染料粗品，然后经柱色谱分离提纯， 获得蓝紫色固体粉末状的Ξ憐酸腺巧近红外巧光探针。
【专利摘要】三磷酸腺苷近红外荧光探针的制备方法，其步骤为：将方酸菁染料溶于有机溶液中，获得方酸菁有机溶液；将N，N-二(2-氨乙基)-1，2-乙二胺溶于有机溶液中，获得N，N-二(2-氨乙基)-1，2-乙二胺有机溶液；将方酸菁有机溶液滴加到N，N-二(2-氨乙基)-1，2-乙二胺有机溶液中，在室温环境下搅拌，去除有机溶液，经柱色谱分离提纯，获得三磷酸腺苷近红外荧光探针；本发明制备的近红外荧光探针能够对ATP快速、灵敏地分析，并克服现有荧光探针的缺点，高效检测ATP，具有合成步骤简单，荧光法分析快捷方便，干扰较小的特点。
【IPC分类】C07D277/64, C09K11/06, G01N21/64
【公开号】CN105541754
【申请号】CN201610066928
【发明人】徐勇前, 孙世国, 陈晖
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月29日