III;
[0072] 3)编码ABC转运蛋白的成套基因:wysG和wysH;
[0073] 4)编码糖基的合成与附着的成套基因:wysDI、wysDII和wysDIII;
[0074] 5)编码其他后修饰蛋白与未知功能蛋白的成套基因：wysL、wysM、wysN、wysE和 wysF〇
[0075] 上述基因簇为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0076] 1)序列表中序列89所不的DNA分子；
[0077] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；
[0078] 3)与1)限定的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0079] 上述严格条件可为在6 X SSC，0 · 5 % SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0080]本发明的实验证明，本发明所涉及的引物具有良好的高效性、特异性及灵敏性，可 用于检测其他链霉菌是否含有聚酮生物合成基因簇。
【附图说明】
[0081 ]图1为wy sR转基因菌株和出发菌株CK-15的分子鉴定。
[0082]图2为wysR转基因菌株和出发菌株CK-15发酵产生武夷菌素的HPLC图谱。
[0083]图3为wysRII转基因菌株和出发菌株CK-15的分子鉴定。
[0084]图4为wysRII转基因菌株和出发菌株CK-15的表型鉴定。
[0085] 图5为wysRII转基因菌株和出发菌株CK-15的菌丝体干重结果。
[0086] 图6为引物特异性检测。
[0087] 图7为引物普遍性检测。
[0088] 图 8 为CK44AF/CK44AR 扩增结果。
[0089] 图 9 为CK44BF/CK44BR 扩增结果。
[0090]图 10 为 CK24F/CK24R 扩增结果。
[0091]图11为引物对灵敏性分析。
【具体实施方式】
[0092] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0093] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0094] 实施例1、聚酮生物合成基因簇的挖掘与全基因组序列扫描
[0095] 通过对链霉菌（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15)基因组 Fosmid文库进行筛选，获得了阳性质粒3E11和6E11。对阳性质粒进行测序分析，共获得约 53kb的序列;结合高通量测序技术对全基因组进行扫描发现，武夷菌素产生菌CK-15基因组 大小约9410232bp，G+C含量高达72.25%。将基因组测序结果提交至 &拉131^3!1，共预测出47 种次生代谢产物生物合成基因簇，其中包含聚酮生物合成基因簇。
[0096] 生物信息学分析表明，聚酮生物合成基因簇的核苷酸序列为序列表中序列89,其 由基因簇122844bp核苷酸组成，共包含22个开放阅读框，其中WysI、WysJ、WysK、WysA、WysB、 WysC6 个基因负责聚酮长链骨架的合成;WysR、WysRII、WysRIII、WysPI、WysPII、WysPIII6 个 编码调控子的基因；WysG、WysH2个基因编码ABC转运蛋白；WysDI、WysDII、WysDIII共3个基 因编码糖基的合成与附着;1 7^7成、175^、17述、17逆共5个基因编码其他后修饰蛋白与 未知功能的蛋白。
[0097]表1聚酮生物合成基因簇的功能分析
[0098]
[0100] 实施例2、用于扩增聚酮生物合成基因簇的引物及试剂盒的制备
[0101] -、用于扩增聚酮生物合成基因簇的最佳引物设计合成
[0102] 根据实施例1获得的聚酮生物合成基因簇，进行引物设计，筛选得到表2所示的扩 增特异性良好的44对引物44，44对引物对于的基因如表3所示。二、引物特异性检测
[0103] 以引物对 WyF23/WyR23、WyF24/WyR24、WyF41/WyR41、WyF42/WyR42、WyF44/WyR44S 例：
[0104] 以武夷菌素产生菌CK-15为模板，分别用表2所示的引物对WyF23/WyR23、WyF24/ %1?24、％?41/^1?41、％?42/^1?42、％?44/^1?44进行？0財广增。
[0105] PCR扩增产物的电泳结果如图6所示，其中，1-5依次为WyF23/WyR23扩增产物、 WyF24/WyR24 扩增产物、WyF41/WyR41 扩增产物、Wy42/WyR42 扩增产物、WyF44/WyR44 扩增产 物，得到片段大小依次为1672bp，1929bp，1868bp，1825bp，1114bp，且均为特异性高的单一 条带。
[0106] 其余38个引物对采用同样的方法检测，特异性均高。
[0107] 三、引物普遍性检测
[0108] 片段由表1的相似性分析中可知，链霉菌中聚酮生物合成基因簇具有一定的保守 性，因此研究设计的引物是否也具有普遍性，以引物对WyF14/WyR14、WyF44/WyR44、WyF7/ WyR7为例：
[0109] 分别以武夷菌素产生菌（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15) 基因组DNA、制霉菌素 （Streptomyces noursei)产生菌（Brautaset T，Sekurova 0N，Sletta H,et al.,Biosynthesis of the polyene antifungal antibiotic nystatin in Streptomyces noursei ATCC 11455:analysis of the gene cluster and deduction of the biosynthetic pathway.Chemistry and Biology，2000,7(6) :395-403.)基因组DNA和 小白链霉菌NK660(Streptomyces albus NK660Gu YY,Yang C,Wang XM，et al.，Genome Sequence of then-Poly-L-Lysine-Producing Strain Streptomyces albulus NK660, Isolated from Soil in Gutian,Fujian Province ,China.Gennome announcements , 2014,2(3):600532-14.)的基因组0嫩为模板，分别用引物对17?15/^1?15、'?^730/^1?30和 WyF8/WyR8 进行 PCR 扩增。
[0110] PCR扩增产物如图7所示，泳道1，2，3分别为武夷菌素产生菌（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15)、制霉菌素 （Streptomyces noursei)产生菌和小 白链霉菌NK660(Streptomyces albus NK660)采用WyF14引物对扩增产物，同时扩增出 2694bp的目的条带，且扩增出条带具有特异性，效果良好;泳道4,5,6分别为武夷菌素产生 菌（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15)、制霉菌素 （Streptomyces noursei)产生菌和小白链霉菌NK660(Streptomyces albus NK660)米用WyF44引物对扩增 产物，均扩增出1114bp的目的条带；泳道7,8，9分别为武夷菌素产生菌（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15)、制霉菌素 （Streptomyces noursei)产生菌和小 白链霉菌NK660 (Streptomyces albus NK660)采用WyF7引物对扩增产物，同时扩增出 2165bp的目的条带，且扩增出条带具有特异性，效果良好。
[0111] 其余38个引物对采用同样的方法检测，特异性均高。
[0112] 综上所述，利用该44个引物对扩增链霉菌中的聚酮化合物生物合成基因簇具有一 定的特异性、可靠性、保守性及普遍性，鉴于上述特点可以用于检测其他链霉菌中是否含有 此类型的聚酮化合物生物合成基因簇。
[0113]表2克隆聚酮生物合成基因簇的引物序列表
[0116] 表3为每个基因对应的引物对
[0117]
[0118]
[0119] 四、引物的选择
[0120] 针对上述一的44个引物对中每一个引物对的靶片段，设计合成用于扩增同一靶片 段的对照引物，但是其特异性较差，或者扩增出的目的条带二聚体较多，或者引物条带不明 显，或者完全不能扩增出目条带，对于这些类型的引物均进行了剔除。
[0121] 对WyF44/WyR44和WyF24/WyR24进行举例说明：
[0122] 设计引物对WyF44/WyR44时同时设计2个对照引物CK44AF/CK44AR和CK44BF/ CK44BR;设计引物对WyF24/WyR24时同时设计CK24F/CK24R。
[0123]以武夷菌素产生菌（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis C