专利名称：arylomycins A生物合成基因簇的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体地说，是关于抗生素arylomycins A的生物合成基因簇。
背景技术：
随着致病菌耐药性问题的日益严峻，临床上对新抗生素的需求也显得更为迫切。为了应对这一局面，人们一方面对已有抗生素进行改造，另一方面也加快了新型抗生素筛选的步伐。Alexandra H0ltzel等在2002年从Streptomyces sp.TU6075分离得到了两组脂月太类化合物 arylomycins,包括 arylomycins A^Parylomycins B (Schimana, Gebhardt etal.2002)。它们都属于六肽化合物，含有相同肽链(D-Me-Ser-D-Ala-Gly-L-Me-Hpg-L-Ala-L-Tyr),不同的是,arylomycins B中的Tyr含有-NO2取代基。最近,我们从Streptomycesparvus CGMCC N0.4027 的发酵液中分离到了 arylomycin A2 和 arylomycin A4,结构如图1所示。2004年,Mark Paetzel 等获得了 arylomycin A2 与Escherichia coli I 型信号妝酶结合复合物2.5-A分辨率的晶体结构，研究发现arylomycin A2的C端可与信号肽酶催化活性中心的Ser和Lys残基侧链形成氢键，同时arylomycin A2形成β -折叠结构模拟信号肽酶底物的结合(Paetzel,Goodall et al.2004)。I 型信号肽酶(SPase I,EC 3.4.21.89)是一种广泛存在于真细菌细胞膜中的丝氨酸蛋白酶，负责将前蛋白N-端的信号肽切除，对细菌的生存和生长至关重要。SPase I被抑制后，会造成分泌蛋白在细胞膜上的大量积累并最终导致细菌死亡(Dalbey and Wickner 1985)。一直以来,病原菌蛋白酶抑制剂被认为药物发展的一个方向，但是对人体的毒害性降低了这些抑制剂最终成药的可能性。区别于经典的Ser/His/Asp催化机制,SPase I利用独特的Ser/Lys催化二元体机制,这就意味着SPase I抑制剂有着更高的特异性，对真核细胞有着更低的毒性。同时，由于催化活性中心位于细胞膜外侧，I型信号肽酶被认为是一种很有潜力的抗生素筛选靶标。虽然已经得到了 arylomycin A2与Escherichia coli SPase I结合复合物的晶体结构,但在最初生物活性石开究中，arylomycins 只对 Streptococcuspneumonia、Staphylococcus epidermidis及土壤微生物Rhodococcus opacus、Brevibacillus brevis有抗菌活性，而对大多的病原菌如 Staphylococcus aureus、Escherichia coli 和 Pseudomonas aeruginosa 没有活性，这大大限制了其成为药物的可能性。但2010年有研究发现，Staphylococcus aureus、Escherichia coli 和 Pseudomonas aeruginosa之所以对 arylomycins 表现出耐药性，是由于这些病原菌的SPase I催化活性中心的Ser突变为Pro从而导致两者的亲和力降低。通过对自然界中厚壁菌门、放 线菌们、变形菌门、拟杆菌门及疣微菌门衣原体属中SPase I相应位置Pro突变的分布研究表明，很多自然界中的细菌不存在Pro突变而对arylomycins表现为敏感，如革兰氏阳性边病原菌 Streptococcus pneumoniae>Streptococcus pyogenes、S.haemolyticus 及革兰氏阴性病原菌 Chlamydia trachomatis 等(Smith, Roberts etal.2010)。因此arylomycins作为广谱性抗生素有着广阔的应用前景。
除了加工与生存及生长相关蛋白，I型信号肽酶与其它生命活动如细菌耐药性、细菌毒素的分泌等，也有着密切关系。例如，一些病原菌由于能分泌内酰胺酶而对内酰胺类抗生素产生耐药性，而研究表明arylomycins类似物Iipoglycopeptides能抑制
S.aureus β-内酸胺酶的分泌(Kulanthaivel, Kreuzman et al.2004)。因此除了直接作为抗生素使用，arylomycins还能够调节细菌毒性或者使得病原菌变得对其它抗生素敏感，这将大大扩大 arylomycins 应用范围(Roberts, Smith et al.2007)。迄今为止,还没有arylomycins生物合成基因簇相关研究的报道。
发明内容
本发明的目的是提供由Streptomyces parvus CGMCC N0.4027菌株产生的具有抗菌活性的抗生素一arylomycins A的生物合成基因簇。根据本发明,抗生素arylomycins A的生物合成基因簇包含8个基因:aryA编码非核糖体肽合成酶NRPS ；aryB编码非核糖体肽合成酶NRPS ；aryC 编码 Ρ4δ0 酶； aryD编码非核糖体肽合成酶NRPS ；aryE编码MbtH家族蛋白；aryF编码轻基扁桃酸合酶Hmas ；
aryG编码轻基扁桃酸氧化酶Hmo ;aryH编码轻基苯甘氨酸氨基转移酶HpgT。根据本发明，所述基因aryA位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第3739-5493个碱基处，长度为1755个碱基对，编码584个氨基酸。根据本发明，所述基因aryB位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第5481-15938个碱基处，长度为10458个碱基对，编码3485个氨基酸。根据本发明，所述基因aryC位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第16567-17736个碱基处，长度为1170个碱基对，编码389个氨基酸。根据本发明，所述基因aryD位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第17795-30688个碱基处，长度为12894个碱基对，编码4297个氨基酸。根据本发明，所述基因aryE位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第30714-30935个碱基处，长度为222个碱基对，编码73个氨基酸。根据本发明，所述基因aryF位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第30983-32047个碱基处，长度为1065个碱基对，编码354个氨基酸。根据本发明，所述基因aryG位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第32044-33159个碱基处，长度为1116个碱基对，编码371个氨基酸。根据本发明，所述基因aryH位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第33152-34501个碱基处，长度为1350个碱基对，编码449个氨基酸。根据本发明，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本发明所提供的包含arylomycins A生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解arylomycins类天然产物的生物合成机制,为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
图1为arylomycin A2及arylomycin A4的化学结构不意图。图2为本发明的arylomycins A生物合成基因簇结构示意图。图3为原始菌株及各突变株发酵液HPLC分析结果图。其中，I为原始菌株，II为orf-Ι敲除突变株，III为orfl敲除突变株，IV为orf2敲除突变株，V为aryA敲除突变株，VI为aryB敲除突变株，VII为aryC敲除突变株，VIII为aryD敲除突变株。图4为arylomycins A中非天然氨基酸HPG的生物合成途径示意图。图5为原始菌株、突变株及HPG补料后各菌株发酵液HPLC分析结果图。其中，I为原始菌株，II为aryF敲除突变株，III为aryG敲除突变株，IV为aryH敲除突变株，V为aryF敲除突变株HPG补料，VI为 aryG敲除突变株HPG补料，VII为aryH敲除突变株HPG补料。图6为arylomycin A2和arylomycin A4的生物合成过程不意图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。本发明所用的菌种为Streptomycesparvus,于2010年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏号CGMCC N0.4027。本发明中所涉及的分子生物学操作参照Practical StreptomycesGenetics (Norwich:John Innes Foundation, 2000)和《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)等进行。实施例1、arylomycins生物合成基因簇的克隆1.1、Streptomyces parvus CGMCC N0.4027 总 DNA 提取将新鲜S.parvus CGMCC N0.4027 斜面孢子接种到 3ml TSB 培养基中，28 °C，220rpm振荡培养30h。取2ml至2ml离心管中，12000rpm离心IOmin,用无菌水洗漆一次,菌丝体重悬于250 μ I SET，并加入溶菌酶至终浓度4mg/ml，37°C水浴40 60min。加入50 μ I10% SDS和2.5μ I 10mg/ml蛋白酶K，于55°C水浴2h，期间不断震荡。然后加入200 μ I5mol/LNaCl和500 μ I氯仿,混勻，室温放置30min, 12000rpm离心15min。取上清,加入Iml异丙醇，12000rpm离心5min，沉淀用70%乙醇洗涤一次并抽干，加入100 μ I TE缓冲溶液于-20°C保存。1.2、arylomycins生物合成基因簇的克隆微生物代谢具有多样性，随着越来越多次级代谢产物生物合成基因簇的获得，发现不同的微生物的基因组中也会含有相同化合物的合成基因簇。如A21978C产生菌Streptomyces roseosporus NRRL 15998虽然没有报道其能够产生核苷肽类抗生素,但在其基因组中发现了类似负责Pacidamycin生物合成的基因簇(Zhang, Ostash et al.2010)。
已知 Streptomycesparvus CGMCC N0.4027 也能够产生 A21978C 系列物质，另外还发现其可以产生arylomycins类代谢产物。在对已经公开的A21978C产生菌Streptomycesroseosporus NRRL15998的基因组进行分析的过程中，发现基因SSGG_05586_SSGG_05590编码非核糖体肽合成酶(NRPS)，其中模块组成、异构化(E)结构域及甲基化(M)结构域与arylomycins结构中肽链组成对应，因此其可能与arylomycins基因簇类似。根据SSGG_05586-SSGG_05590上下游序列，利用Vector NTI软件设计引物，以1.1中制备的
S.parvus CGMCC N0.4027染色体为模板逐段PCR。 PCR 反应体系(50 μ I)包括 PrimerSTAR HS DNA 聚合酶(2.5U/ μ I) 0.5 μ 1、2 X GC缓冲液 25 μ 1、dNTP (浓度各为 2.5πιΜ)4μ1、引物(2OmM)各 0.5 μ 1、Streptomyces parvusCGMCC N0.4027 总 DNA I μ UdH2O 18.5 μ I。反应条件为:94°C预变性 3min ;94°C变性 lmin，58 68°C复性30s，72°C延伸2.5min，共30个循环；最后72°C延伸lOmin。低熔点胶回收预期大小DNA片段,与pMD18_T simple Vector连接,转化E.coliDH5a，涂布于含有ΙΟΟμ g/ml氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养。挑取单菌落过夜培养，抽提质粒，根据大小将可能含有预期大小DNA片段的质粒测序。引物序列及PCR产物大小如表I所示。最终将所得16个片段拼接起来，所得序列总长为39503bp，GC含量为71.9%。核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。表1、引物序列及PCR产物大小
权利要求
1.抗生素arylomycinsA的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包含8个基因: aryA编码非核糖体肽合成酶NRPS ； aryB编码非核糖体肽合成酶NRPS ； aryC编码P450酶； aryD编码非核糖体肽合成酶NRPS ； aryE编码MbtH家族蛋白； aryF编码轻基扁桃酸合酶Hmas ； aryG编码轻基扁桃酸氧化酶Hmo ； aryH编码轻基苯甘氨酸氨基转移酶HpgT。
2.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryA位于SEQ·ID NO:1所示的核苷酸序列的第3739-5493个碱基处，长度为1755个碱基对，编码584个氨基酸。
3.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryB位于SEQID N0:1所示的核苷酸序列的第5481-15938个碱基处，长度为10458个碱基对，编码3485个氨基酸。
4.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryC位于SEQID N0:1所示的核苷酸序列的第16567-17736个碱基处，长度为1170个碱基对，编码389个氨基酸。
5.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryD位于SEQID N0:1所示的核苷酸序列的第17795-30688个碱基处，长度为12894个碱基对，编码4297个氨基酸。
6.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryE位于SEQID N0:1所示的核苷酸序列的第30714-30935个碱基处，长度为222个碱基对，编码73个氨基酸。
7.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryF位于SEQID N0:1所示的核苷酸序列的第30983-32047个碱基处，长度为1065个碱基对，编码354个氨基酸。
8.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryG位于SEQID NO:1所示的核苷酸序列的第32044-33159个碱基处，长度为1116个碱基对，编码371个氨基酸。
9.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryH位于SEQID N0:1所示的核苷酸序列的第33152-34501个碱基处，长度为1350个碱基对，编码449个氨基酸。
10.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因簇的核苷酸序列如SEQID NO:I所示。
全文摘要
本发明公开了由Streptomyces parvus CGMCC No.4027菌株产生的具有抗菌活性的抗生素--arylomycins A的生物合成基因簇。整个基因簇共包含8个基因3个NRPS基因(aryA、aryB、aryD)；1个后修饰基因(aryC)；3个前体合成基因(aryF、aryG、aryH)以及1个MbtH基因(aryE)。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断arylomycin A2和arylomycinA4的合成。本发明所提供的基因也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
文档编号C12N15/52GK103160521SQ20111042220
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者靳旭, 饶敏, 魏维, 戈梅, 朱丽, 陈玲玲, 万明玉 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司, 上海交通大学