量子点荧光探针及其制备方法和应用以及检测弹性蛋白酶活性的方法和试剂盒与流程

本发明涉及弹性蛋白酶活性检测领域，具体涉及一种量子点荧光探针，该量子点荧光探针的制备方法和应用，以及一种检测弹性蛋白酶活性的方法和试剂盒。

背景技术：

弹性蛋白酶的主要功能是水解胞外弹性蛋白，使免疫细胞能够快速到达炎症部位清除病原体，但是如果弹性蛋白酶活性过高的话就会引发一系列肺部疾病，比如慢性阻塞性肺病，包括肺气肿、慢性支气管炎以及哮喘，还会使肺囊泡纤维化，使呼吸功能逐渐衰竭，除此之外，过多的弹性蛋白还会水解免疫蛋白，使机体的免疫能力下降从而引发肺癌。

而目前用于检测弹性蛋白酶活性的探针主要是通过它的紫外底物nmeosuc-aapv-pna，荧光底物nmeosuc-aapv-amc，以及基于香豆素的小分子荧光探针，除此之外还有基于荧光蛋白或者多肽底物的fret探针，不过这些探针在应用方面都有一定的局限，首先是检测限，这些探针的检测限都在纳摩尔水平，而患者支气管肺泡灌洗液中弹性蛋白酶的活性往往很低难以被检测到，除此之外，这些探针几乎都难以被应用到细胞甚至活体水平，所以应用被限制，因此开发高灵敏度而且能应用于细胞和活体水平的探针十分有必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前现有技术中存在的上述缺陷，提供一种性质稳定、操作简单、易于储运、灵敏度更高、选择性更好以及可以应用于细胞、血清、尿液、甚至活体水平的弹性蛋白酶活性检测荧光探针及其应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种量子点荧光探针，该量子点荧光探针包括核壳结构的半导体量子点，罗丹明衍生物以及连接在所述半导体量子点和所述罗丹明衍生物之间的弹性蛋白酶特异性多肽；

其中，所述半导体量子点为以cdse为核以zns为壳的cdse@zns半导体量子点。

优选的，所述半导体量子点的表面还修饰有聚乙二醇。

优选的，所述聚乙二醇为带有羧基的聚乙二醇。

优选的，所述罗丹明衍生物为磺酰罗丹明b。

优选的，所述弹性蛋白酶特异性多肽的氨基酸序列如seqidno：1所示。

本发明第二方面提供了如上所述的量子点荧光探针的制备方法，该方法包括：

(1)将碳二亚胺盐酸盐和n-羟基硫代琥珀酰亚胺与所述半导体量子点进行接触，以对所述半导体量子点表面的羧基进行活化；

(2)将步骤(1)得到半导体量子点表面的活化羧基与连接有罗丹明衍生物的弹性蛋白酶特异性多肽的氨基进行反应，得到所述量子点荧光探针。

本发明第三方面提供了如上所述的量子点荧光探针在检测弹性蛋白酶活性中的应用。

本发明第四方面提供了一种检测弹性蛋白酶活性的方法，该方法包括：将含有弹性蛋白酶的待测样品与如上所述的量子点荧光探针接触，得到接触后的物料；

检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度f535nm/f590nm随时间的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；

其中，所述激发光的波长为300-400nm，所述荧光的发射波长分别为535nm和590nm；f535nm为发射波长535nm下所述半导体量子点的荧光强度，f590nm为发射波长590nm下罗丹明衍生物的荧光强度。

本发明第五方面提供了一种检测弹性蛋白酶活性的试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的量子点荧光探针、待测弹性蛋白酶的标准品以及反应缓冲液。

本发明提供的量子点荧光探针在用于检测蛋白水解酶特别是弹性蛋白酶活性时，与弹性蛋白酶具有更高的亲和力，检测的有效性更高。

本发明提供的量子点荧光探针在检测弹性蛋白酶活性时，具有特别明显的优势，这主要得益于比率型荧光探针双通道发射信号的特征，可以有效的降低系统误差以及消除浓度和其他环境因素的影响，因此灵敏度更高。本发明优选选用的肽链seqidno：1具有十分高的特异性，可以分辨弹性蛋白酶同家族的其他蛋白包括组织蛋白酶g，蛋白酶3，但是弹性蛋白酶的商品化紫外底物和荧光底物就无法做到这一点。

本发明提供的量子点荧光探针，是第一次将纳米材料核壳半导体量子点引入到检测弹性蛋白酶的体系中，由于该核壳量子点优秀的光学性质，它与传统的有机染料分子以及荧光坦白相比稳定性更高、荧光更强，激发波长在300-400nm区域，不会被受体罗丹明吸收，荧光也不会被干扰，而且优选通过在量子点表面修饰聚乙二醇(peg)配体，特别是带有羧基的peg配体，其在细胞中以及生物体中具有更好的相容性。

附图说明

图1本发明一种具体的弹性蛋白酶催化荧光探针的示意图。

图2是本发明一种具体的弹性蛋白酶催化荧光探针水解反应示意图。

图3为本发明一种具体的量子点荧光探针对弹性蛋白酶的专一性示意图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明一方面提供一种量子点荧光探针，该量子点荧光探针包括核壳结构的半导体量子点，罗丹明衍生物以及连接在所述半导体量子点和所述罗丹明衍生物之间的弹性蛋白酶特异性多肽；

其中，所述半导体量子点为以cdse为核以zns为壳的cdse@zns半导体量子点。

优选的，本发明提供的量子点荧光探针通过弹性蛋白酶特异性多肽的第一个氨基酸和最后一个氨基酸将半导体量子点与罗丹明衍生物相连，从而构成了荧光共振能量转移体系(fret)。

根据本发明，为了进一步增加所述量子点荧光探针的灵敏性、选择性以及其在细胞中和生物体中的相容性，优选的，所述半导体量子点的表面还修饰有聚乙二醇，更优选的，所述聚乙二醇为带有羧基的聚乙二醇。

根据本发明，为了进一步增加所述量子点荧光探针的灵敏性、选择性以及其在细胞中和生物体中的相容性，优选的，所述弹性蛋白酶特异性多肽通过酰胺键(由半导体量子点与弹性蛋白酶特异性多肽的氨基所形成)与所述半导体量子点相连，通过磺酰胺键(由罗丹明衍生物与弹性蛋白酶特异性多肽的氨基所形成)与罗丹明衍生物相连。

根据本发明，为了进一步增加所述量子点荧光探针的灵敏性、选择性以及其在细胞中和生物体中的相容性，优选的，所述罗丹明衍生物为磺酰罗丹明b，其结构式为

根据本发明一种具体的实施方式，所述弹性蛋白酶为中性粒细胞弹性蛋白酶(由中性粒细胞分泌的一种丝氨酸蛋白水解酶)，所述弹性蛋白酶特异性多肽的氨基酸序列优选如seqidno：1(qpmavvqsvpqk)所示，所述罗丹明衍生物优选为磺酰罗丹明b。如图1所示，所述半导体量子点通过其自身的羧基与seqidno：1的5’端的谷氨酰胺(q)的氨基形成酰胺键连接，磺酰罗丹明b的第4位磺酸基与seqidno：1的3’端的赖氨酸(k)的氨基形成磺酰胺键连接。在该优选的情况下，所述量子点荧光探针对弹性蛋白酶具有极高的特异性和灵敏度。

其中，图2示出了弹性蛋白酶催化图1所示的量子点荧光探针水解的示意图，在弹性蛋白酶的催化下，seqidno：1所示的多肽序列断裂为连接有半导体量子点的seqidno：2(qpmav)和连接有磺酰罗丹明b的seqidno：3(vqsvpqk)。

本发明第二方面提供了如上所述的量子点荧光探针的制备方法，该方法包括：

(1)将碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)与所述半导体量子点进行接触，以对所述半导体量子点表面的羧基进行活化；

(2)将步骤(1)得到半导体量子点表面的活化羧基与连接有罗丹明衍生物的弹性蛋白酶特异性多肽的氨基进行反应，得到所述量子点荧光探针。

根据本发明，所述半导体量子点以及表面修饰有聚乙二醇或带有羧基的聚乙二醇的半导体量子点可以通过本领域公知的方法进行自行合成，也可以通过商购获得，还可以通过向相关公司定制得到，例如，可以向苏州星烁纳米科技有限公司定制得到。

另外，所述连接有罗丹明衍生物的弹性蛋白酶特异性多肽可以通过本领域公知的方法进行自行合成，也可以通过商购获得，还可以通过向相关公司定制得到，例如，可以向浙江湃肽生物有限公司定制得到。

根据本发明，在对所述半导体量子点的羧基进行活化时，edc和nhs的用量可以在较宽的范围内进行选择，只要能够有效将半导体量子点自身的羧基活化即可。优选的，所述半导体量子点的用量与碳二亚胺盐酸盐的用量的摩尔比为1:2000-6000，更优选为1:3000-5000，最优选为1:4000；碳二亚胺盐酸盐的用量和n-羟基硫代琥珀酰亚胺的用量的摩尔比为1:1.5-3.5，更优选为1:2-3，最优选为1:2.5。

根据本发明，所述接触的条件也没有特别的限制，优选的，接触的温度为20-37℃，ph值为5.5-6.0，时间为20-40min。

优选的，所述接触在缓冲液中进行，所述缓冲液可以为本领域常规的各种缓冲液，优选的，所述缓冲液为mes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，其ph值为5.5-6.0。

根据本发明，为了进一步提高最终所制备的量子点荧光探针的纯度，在步骤(1)的所述接触反应完成之后，所述方法还优选包括将接触后的产物进行超滤处理，以除去未反应的edc和nhs。其中，所述超滤处理所用滤膜的孔径本领域技术人员可以根据edc和nhs以及半导体量子点的分子大小进行适当的选择。

优选的，超滤结束后使用pbs缓冲液溶解接触产物，并将体系的ph值控制在反应的ph值。

根据本发明，所述反应的条件也没有特别的限制，优选的，接触的温度为25-37℃，ph值为7.0-7.4，时间为8-12h。

根据本发明，步骤(2)中，表面羧基活化的半导体量子点与连接有罗丹明衍生物的弹性蛋白酶特异性多肽的用量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，所述表面羧基活化的半导体量子点的摩尔用量高于连接有罗丹明衍生物的弹性蛋白酶特异性多肽的摩尔用量，优选为1：150-250，更优选为1:200。

根据本发明，根据本发明，为了进一步提高最终所制备的量子点荧光探针的纯度，在步骤(2)的所述反应完成之后，所述方法还优选包括将反应后的产物进行超滤处理，以除去未反应的物料。其中，所述超滤处理所用滤膜的孔径本领域技术人员可以根据目标产物以及反应原料的分子大小进行适当的选择。

优选的，为了进一步提高最终所制备的量子点荧光探针的纯度，超滤结束后，本发明的方法还包括使用ph值为7.4的pbs缓冲液对超滤产物进行洗涤。其中，洗涤过程中使用的pbs缓冲液的ph值优选高于步骤(2)中反应的ph值。

本发明第三方面提供了如上所述的量子点荧光探针在检测弹性蛋白酶活性中的应用。

本发明第四方面提供了一种检测弹性蛋白酶活性的方法，该方法包括：将含有弹性蛋白酶的待测样品与如上所述的量子点荧光探针接触，得到接触后的物料；

检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度f535nm/f590nm(d/a)随时间的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；

其中，所述激发光的波长为300-400nm，所述荧光的发射波长分别为535nm和590nm；f535nm为发射波长535nm下所述半导体量子点的荧光强度，f590nm为发射波长590nm下罗丹明衍生物的荧光强度。

根据本发明，将含有弹性蛋白酶的待测样品与本发明所述的量子点荧光探针在缓冲液中接触，以使所述探针被弹性蛋白酶水解，水解后能量共振转移消失，通过检测水解后物料在激光器下发出的荧光强度(f535nm/f590nm＝d/a)则可反映弹性蛋白酶的活性。其中，单位时间内d/a比的增加值指示了弹性蛋白酶的活性，所述的激发光的波长为300-400nm，所述荧光的发射波长分别为535nm量子点的荧光强度以及590nm罗丹明衍生物的荧光强度。

在本发明所述的弹性蛋白酶活性的检测方法中，量子点探针的用量范围与待测弹性蛋白酶样品及种类有关，通常情况下，量子点荧光探针的用量能够达到表征弹性蛋白酶待测样品的活性即可，优选情况下，相对于待测样品中每1nm的弹性蛋白酶，所述量子点荧光探针的用量可以为1-100nm，为了达到最佳的检测效果，量子点荧光探针的用量优选为10-50nm。

在本发明提供的弹性蛋白酶活性的检测方法中，所述弹性蛋白酶待测样品与量子点荧光探针接触的条件包括：温度为25-37℃，ph值为6-8，时间为1-20min。优选情况下，所述接触的条件包括：温度为25-30℃，ph值为7.5，时间为1-10min。

本发明所述的检测方法中，所述接触在避光条件下进行，并对接触的容器进行预热，以保持待测样品的生物活性。优选地，所述接触的反应容器为黑色平底孔板、比色杯或酶标板，并且在接触前将参加接触的各组分及反应容器预热至适宜的反应温度，预热所要达到的温度优选为25-37℃。

本发明所述的弹性蛋白酶活性的检测方法的条件还包括在100mm的tris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液中进行，所述接触前可以将适量的含弹性蛋白酶样品、20nm量子点荧光探针分别与50-150μl所述tris-hcl缓冲液混合。

对所述弹性蛋白酶待测样品与量子点荧光探针接触后的物料的荧光强度的检测可以在酶标仪或荧光分光光度计中进行，可以采用时间依赖性检测的方法获得弹性蛋白酶在接触过程中催化量子点荧光探针水解的荧光光谱随时间变化的情况，通过检测水解后物料在激光器下发出的荧光强度(f535nm/f590nm＝d/a)来反映弹性蛋白酶的活性。其中，单位时间内d/a比的增加值指示了弹性蛋白酶的活性。此外，可以采用多次重复试验和设置若干对照组的方式保证检测的可靠性。

当所述量子点荧光探针为式1所示结构时，本发明所述的方法可以用于样品中弹性蛋白酶活性的测定，也可以用于确定待测样品中的蛋白水解酶是否为弹性蛋白酶。

本发明所述的检测弹性蛋白酶活性的方法可以应用于本领域任何涉及弹性蛋白酶活性的检测，例如，弹性蛋白酶活性的检测，弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的筛选，弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的动力学表征等，同时本发明所述的方法也可用于相关疾病的诊断和治疗，但本发明并不仅限于此。

当本发明所述的检测弹性蛋白酶活性的方法用于弹性蛋白酶抑制剂的筛选时，可以分别将含有特定浓度的弹性蛋白酶、一定浓度的各种抑制剂或有机化合物溶液以及100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)置于30℃恒温水槽中预热；同时将黑色平底96孔板置于30℃孵育箱中预热。随后，使适量的已经预热的tris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲溶液、相同体积的各种弹性蛋白酶抑制剂和适量的量子点荧光探针与弹性蛋白酶接触。并用酶标仪或者全功能的荧光分光光度计对样品的荧光强度进行时间依赖性的监测。

本发明的第五方面还提供一种检测样品中弹性蛋白酶活性的试剂盒，该试剂盒包括：如上量子点荧光探针、待测弹性蛋白酶的标准品以及反应缓冲液，所述弹性蛋白酶标准品在检测时可以用作为阳性对照组或绘制标准曲线。

本发明所提供的试剂盒可以应用于检测待测样品中弹性蛋白酶的活性，筛选弹性蛋白酶抑制剂或促进剂以及其它与弹性蛋白酶活性检测或弹性蛋白酶抑制剂或促进剂功能相关的领域，另外，本试剂盒也可用于与弹性蛋白酶活性检测有关的医学检测和治疗领域，但本发明并不仅限于此。

本发明所提供的试剂盒中，反应需要在反应缓冲液中进行，优选地，反应缓冲液为100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)，本试剂盒的保存条件为负20℃避光保存。所述试剂盒的具体使用方法可以按照以下所列举的方法进行：

(1)配置500nm量子点荧光探针的pbs(ph＝7.4)溶液，并且在2℃至8℃下避光保存以备用。

(2)将弹性蛋白酶标准品用100mm的tris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液溶解，配制成100μg/ml的弹性蛋白酶标准品溶液，并以10倍的稀释度进行梯度稀释。

(3)将含有弹性蛋白酶的待测样品用100μl的100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液溶解。

(4)分别将200μl的tris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液，量子点荧光探针、待测的弹性蛋白酶样品和蛋白水解酶标准品加入于黑色酶标板中。利用本发明所述的检测弹性蛋白酶活性的方法检测待测样品和弹性蛋白酶标准品中弹性蛋白酶的活性。

(5)以检测到的梯度稀释的弹性蛋白酶标准品的荧光强度变化值绘制标准曲线，通过比对确定被检测的样品中弹性蛋白酶的活性。

当本发明的试剂盒用于弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的筛选时，可以将所述抑制剂在检测前以适当比例或粘度添加于反应混合液中。随后加入适量的弹性蛋白酶标准品启动反应，反应的条件为25-37℃，时间为1-15min。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，

所使用的多肽类底物suc-ala-ala-ala-pna为购自sigma-aldrich试剂公司产品编号为70967-97-4的市售品。

酶标仪购自moleculardevices公司，型号spectramaxm5。

带羧基的聚乙二醇修饰的半导体量子点cdse@zns定制于苏州星烁纳米科技有限公司，并附带有制备成功的检测报告。

不带羧基的聚乙二醇修饰的半导体量子点cdse@zns定制于苏州星烁纳米科技有限，并附带有制备成功的检测报告。

没有修饰的导体量子点cdse@zns定制于苏州星烁纳米科技有限，并附带有制备成功的检测报告。

连接有磺酰罗丹明b的seqidno：1定制于浙江湃肽生物有限公司，并附带有制备成功的检测报告。

以下实施例中所使用的酶的来源及参数如下：

乙酰胆碱酯酶购自sigma-aldrich(c1682)比活力≥1,500u/mg

丁酰胆碱酯酶购自sigma-aldrich(c1057)比活力≥900u/mg

胰蛋白酶购自玛雅公司(10020)比活力≥250u/mg

人中性粒细胞弹性蛋白酶购自biovision公司(4716-100)比活力≥50u/mg糜蛋白水解酶购自玛雅公司(10001)比活力≥1500u/mg

羧肽酶购自worthington(cls005304)比活力≥170u/mg

以下实施例中双通道荧光强度比值变化率(δr/δt)按照以下公式计算：

其中，r2表示t2时刻样品在535nm处的荧光强度与590nm荧光强度的比值，r1表示t1时刻样品在535nm处的荧光强度与590nm荧光强度的比值

紫外可见吸收值的变化率(δa/δt)按照以下公式计算：

其中，a2表示t2时刻样品在405nm处的紫外可见吸收值，a1表示t1时刻样品在405nm处的紫外可见吸收值。

制备例1

本制备例用于说明本发明的量子点荧光探针的制备

(1)在ph值为6.0的mes缓冲液中，将edc和nhs分别与如上定制的3种半导体量子点于室温下进行接触30min，以对所述半导体量子点表面的羧基进行活化；其中，量子点的摩尔量与edc的摩尔量之比为1：4000，edc与nhs的摩尔量之比为2：5。

(2)将接触后的产物通过截留分子量为10kd的超滤膜进行超滤，以去除未反应的edc和nhs，之后进行pbs缓冲液交换使体系的ph＝7.2。

(3)分别将步骤(2)得到半导体量子点表面的活化羧基与连接有磺酰罗丹明b的seqidno：1的氨基于30℃反应8-12小时。其中，表面的羧基活化的半导体量子点与连接有磺酰罗丹明b的摩尔比为1：200。

(4)将反应后的产物通过截留分子量为10kd的超滤膜进行超滤，去除未反应的连接有磺酰罗丹明b的seqidno：1，然后用ph＝7.4的pbs溶液反复洗涤，直到滤液中不再有连接有磺酰罗丹明b的seqidno：1，分别得到然后将得到量子点荧光探针1(半导体量子点修饰有带羧基的聚乙二醇)量子点荧光探针2(半导体量子点修饰有不带羧基的聚乙二醇)和量子点荧光探针3(半导体量子点没有修饰，如图1所示)，并保存于ph＝7.4的pbs溶液中以备用。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的量子点荧光探针对弹性蛋白酶活性进行检测的方法。

将100μg弹性蛋白酶样品溶解于100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液中并进行梯度稀释，按表1中给出的浓度配制不同浓度的弹性蛋白酶标准品溶液，将配置获得的弹性蛋白酶标准品溶液置于30℃恒温水槽中预热；同时将黑色平底96孔板置于30℃孵育箱中预热。随后，各取40μl已预热的弹性蛋白酶标准品溶液于预热的黑色平底96孔板中，再加入120μl100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液，并设置阴性对照组(只加160μl的缓冲液)，在避光条件下，将40μl量子点荧光探针1分别与弹性蛋白酶标准品及对照组缓冲液接触，用酶标仪对各弹性蛋白酶标准品溶液及对照组溶液在350nm的激发光下的接触后荧光强度进行动力学扫描，获得第1-10分钟内的535nm处的荧光强度与590nm处荧光强度的比值随时间的变化率，结果列于表1。

对比例1

该对比例用于说明现有技术中弹性蛋白酶活性的检测方法。

采用与实施例1相同的方法检测弹性蛋白酶标准品催化系列浓度梯度的底物水解的情况，不同的是，所用的底物探针为suc-ala-ala-ala-pna(购自sigma-aldrich公司，产品编号为70967-97-4)，在波长为405nm处对接触后紫外可见吸光度进行动力学扫描，获得第1-10分钟内的紫外可见吸收值的变化率，结果列于表1。

表1

测试例1

本测试例用于说明本发明提供的弹性蛋白酶活性检测方法的专一性。

分别将1mg待测样品(乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和羧肽酶)溶解于100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液中配置浓度为10μg/ml的待测样品的溶液并置于30℃恒温水槽中预热；同时将黑色平底96孔板置于30℃孵育箱中预热。随后，各取20μl已预热的待测样品的溶液于预热的黑色平底96孔板中，再加入130μl100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液，在避光条件下，将50μl式1所示结构的量子点荧光探针分别与各个待测样品接触，同时设置未加待测样品的对照组，用酶标仪在350nm的激发光下检测10分钟内各种待测样品催化50μl量子点荧光探针1水解的相对速率，结果如图3所示。

实施例2

本实施例用于说明根据本发明的弹性蛋白酶抑制剂的筛选方法。

将100μg弹性蛋白酶样品溶解于100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液中配置弹性蛋白酶浓度为400ng/ml的待测胰蛋白酶标准品溶液，将弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠(sigma-aldrich，s7198)溶解于1ml100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液中配置成浓度梯度为50、100、150、200、300、400、600、800、1000nm的抑制剂溶液，将0.5nmol式1所示结构的量子点荧光探针溶解于100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液中配置成浓度为100nm的荧光探针溶液，分别将配置获得的弹性蛋白酶标准品溶液、弹性蛋白酶抑制剂溶液和量子点荧光探针1溶液置于30℃恒温水槽中预热；同时将黑色平底96孔板置于30℃孵育箱中预热。随后，分别将20μl各浓度梯度的弹性蛋白酶抑制剂溶液、90μl100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液和40μl荧光探针溶液加入到黑色平底96孔板中混合为实验组，并设立110μl100mmtris-hcl(含有500mmnacl，ph＝7.5)缓冲液和40μl量子点荧光探针1溶液混合的对照组，在避光条件下，分别在实验组和对照组中用排枪迅速加入50μl弹性蛋白酶标准品溶液启动反应。最后用酶标仪分别对实验组和对照组荧光强度的变化和紫外可见吸收值的变化进行检测，结果列于表2。

对比例2

本对比例用于说明采用现有技术的弹性蛋白酶抑制剂的筛选方法。

采用与实施例2相同的方法进行弹性蛋白酶抑制剂的筛选，不同的是，将荧光探针溶液换为sigma-aldrich试剂公司的多肽类底物suc-ala-ala-pro-val-pna，其终浓度为200mm，可见光的吸收波长为405nm。结果列于表2。

表2

通过实施例1的结果可以看出，利用本法所提供的方法，可以对样品中的弹性蛋白酶的活性进行简单灵敏的检测，而且通过实施例1与对比例1的结果可以看出，通过本发明提供的方法，本发明所提供的方法中所使用的式1所示的化合物荧光探针与现有的多肽类底物荧光探针相比具有更高的灵敏度和亲和力。

通过测试例1的结果可以看出，弹性蛋白酶对本发明所提供的方法中所使用的式1所示的的量子点荧光探针的水解能力明显的高于其他种类的酶，因此，本发明的方法所使用的量子点荧光探针对酶的专一性高。

通过实施例1和对比例1可以看出，本发明所提供的量子点荧光探针能够测定纳克级别的弹性蛋白酶的活性，而对比例只能测定微克级别的弹性蛋白酶，因此可以说明本发明所使用的量子点荧光探针比目前的检测方法具有更高的灵敏度和更低的检测限。

此外通过实施例2和对比例2的结果可以看出本发明所提供的方法能够用于弹性蛋白酶抑制剂的筛选。并且，值得一提的是，本发明提供的弹性蛋白酶抑制剂的筛选方法与采用多肽类底物荧光探针相比，荧光信号的变化范围较大易于检测的进行，而多肽类底物荧光探针的紫外可见吸收值的变化率小，不易于检测的进行，本发明所提供的量子点荧光探针具有更高的原子经济性。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的量子点荧光探针对弹性蛋白酶活性进行检测的方法。

按照实施例1所述的方法进行弹性蛋白酶活性的检测，不同的是，量子点荧光探针为量子点荧光探针2。

第1-10分钟内的535nm处的荧光强度与590nm处荧光强度的比值随时间的变化率，结果列于表3。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的量子点荧光探针对弹性蛋白酶活性进行检测的方法。

按照实施例1所述的方法进行弹性蛋白酶活性的检测，不同的是，量子点荧光探针为量子点荧光探针3。

第1-10分钟内的535nm处的荧光强度与590nm处荧光强度的比值随时间的变化率，结果列于表3。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的量子点荧光探针对弹性蛋白酶活性进行检测的方法。

按照制备例1的方法进行量子点荧光探针4的制备，不同的是，将磺酰罗丹明b替换为磺基罗丹明101。

按照实施例1所述的方法进行弹性蛋白酶活性的检测，不同的是，量子点荧光探针为量子点荧光探针4。

第1-10分钟内的535nm处的荧光强度与590nm处荧光强度的比值随时间的变化率，结果列于表3。

表3

通过实施例1与实施例3-5的结果可以看出，当采用优选的聚乙二醇修饰的半导体量子点，更优选为带羧基的聚乙二醇修饰的半导体量子点，或者优选采用磺酰罗丹明b可以对样品中的弹性蛋白酶的活性检测更加灵敏。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>华中师范大学

<120>量子点荧光探针及其制备方法和应用以及检测弹性蛋白酶活性的方法和试剂盒

<130>i49637ccnu

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

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<213>artificialsequence

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