专利名称：检测赭曲霉毒素a含量的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测药物含量的试剂盒，特别是检测饲料中赭曲霉毒素A含量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA (Enzyme Linked Immunosorbnent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。
背景技术：
赭曲霉毒素A (Ochratoxin A)由曲霉和青霉两类霉菌产生，常污染食品和饲料。赭曲霉毒素A能引起动物急性和慢性毒性，是强致癌物质，可对肾脏造成不可逆的致死毒害，引起肾脏萎缩，还可使胎儿畸形、流产甚至死亡，严重影响动物的机能和生长状况，其对人类的潜在危害备受关注。为此，国际癌症研究机构JARC将其定位II B类致癌物，加强对赭曲霉毒素A检测是防止被赭曲霉毒素A污染食物和饲料直接或间接进入人类食物链重要方法。目前,赭曲霉毒素A的残留分析方法主要有化学分析法和免疫化学分析法,化学分析法最早应用于毒素的残留检测，在1973年薄层层析法即成为国际化学分析协会(ACAC)检测赭曲霉毒素A的官方方法，薄层层析法的优点是方法简单，使用的试剂价格便宜，但是存在灵敏度较差，所需试剂繁多，检测周期长，仪器检测，如液相-质谱联用法具有灵敏度高等特点，但是设别昂贵，需要复杂的样品前处理，不适合现场监控和大量样本的筛查。
实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的赭曲霉毒素A残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，可同时进行多个样品中赭曲霉毒素A含量的检测，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种检测赭曲霉毒素A含量的ELISA试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、11瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被赭曲霉毒素A偶联抗原制成的检测板，11瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、浓缩酶结合物、酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液。试剂盒盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，浓缩酶结合物用红色帽的白色PE塑料瓶，酶结合物稀释液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被赭曲霉毒素A偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，Iml/瓶；浓缩酶结合物I瓶，O. 7ml ;酶结合物稀释液I瓶，14ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml。试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的赭曲霉毒素A将和酶标板微孔条上预包被偶联抗原竞争赭曲霉毒素A的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中赭曲霉毒素A的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中赭曲霉毒素A含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒检测饲料(原料、配合料和浓缩料)样本中赭曲霉毒素A残留，具有很高的灵敏度(I μ g/L)，样本的最低检测限为IOy g/kg，回收率为90%±20%。本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、振荡器、离心机、微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、准确地用于赭曲霉毒素A含量的检测。
图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶标板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图6为本实用新型固定泡沫模具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具侧视图。
具体实施方式
参见附图酶标反应微孔条(2)预包被赭曲霉毒素A偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；白色帽的白色塑料试剂瓶(5)用于封装7ml底物液A液，红色帽的黑色塑料试剂瓶(5)用于封装7ml底物液B液，黄色帽的白色塑料试剂瓶(5)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶
(6)用于封装O. 7ml浓缩酶结合物，绿色帽的白色塑料试剂瓶(6)用于封装14ml酶结合物稀释液，白色帽的白色塑料瓶(7)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(8)瓶位放置位置依次为7ml底物液A液瓶位(10)，7ml底物液B液瓶位(11)，7ml终止液瓶位(12)，14ml酶结合物稀释液瓶位(13)，O. 7ml浓缩酶结合物瓶位(14)，6瓶Iml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(15 )，盒体(9 )是硬纸盒。(一)使用试剂盒检测赭曲霉毒素A的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20_25°C /68-77 °F)回温，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。[0023]3、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。4、酶结合物工作液配制根据需要量将浓缩酶结合物用酶结合物稀释液按照1:20的体积进行稀释(即I份浓缩酶结合物加入20份酶结合物稀释液)。5、加标准品/样本、酶结合物工作液加标准品/样本20 μ I到对应的微孔中，随即加入酶结合物工作液100 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应 IOmin06、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用去离子水250 μ I/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。7、显色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应5min。8、测定加入终止液50 μ I/孔，振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。(二)结果判定(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即
权利要求1.一种检测赭曲霉毒素A含量的ELISA试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、11瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被赭曲霉毒素A偶联抗原制成的检测板，11瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、浓缩酶结合物、酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，浓缩酶结合物用红色帽的白色PE塑料瓶，酶结合物稀释液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被赭曲霉毒素A偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，Iml/瓶；浓缩酶结合物I瓶，O. 7ml ;酶结合物稀释液I瓶，14ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测赭曲霉毒素A的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、浓缩酶结合物、酶结合物稀释液、6个浓度的标准品溶液、底物液A液、底物液B液、终止液。采用竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的赭曲霉毒素A与酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争赭曲霉毒素A的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含赭曲霉毒素A的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中赭曲霉毒素A的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在赭曲霉毒素A的残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/545GK202903792SQ20122035400
公开日2013年4月24日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者万宇平, 冯才伟, 陶光灿, 彭鸽, 吴小胜, 何丽霞, 张禹 申请人:北京勤邦生物技术有限公司