一种分析油料粕中矿物质在芽孢杆菌发酵生产伊枯草菌素A中作用的方法与流程

本发明涉及微生物发酵和分析领域，特别涉及分析油料粕等含有不同组分的农副产物中矿物质在其它微生物代谢产物中的作用。

背景技术：

油料粕是油菜籽、芝麻等加工后的副产物，富含多种营养物质，尤其是蛋白质含量约为35％～45％，因此常常被用作氮源用于微生物发酵。但是，油料粕中还含有很多其它物质，如纤维素、矿物质、酚类物质、油脂等，其中矿物质由于无法分离提取，因此到目前为还没有分析油料粕中矿物质在微生物发酵中作用的方法。

技术实现要素：

为了解决到目前为还没有分析油料粕中矿物质在微生物发酵中作用的方法的问题，本发明提供了一种分析油料粕中矿物质在芽孢杆菌发酵生产伊枯草菌素a中作用的方法，发现油料粕不仅可以作为氮源使用，其中的矿物质同样也可以代替微生物发酵所需的无机盐。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

分析油料粕中矿物质在芽孢杆菌发酵生产伊枯草菌素a中作用的方法，所述方法为：

第一步，分别以油料粕或所述油料粕的提取蛋白作为氮源，以葡萄糖作为碳源，分别在添加或不添加无机盐两种条件下，与水混合作为培养基，灭菌后利用解淀粉芽孢杆菌发酵油料粕或油料粕提取蛋白生产伊枯草菌素a，分别记录伊枯草菌素a的产量；

第二步，比较第一步中分别以油料粕或油料粕提取蛋白作为氮源时，所对应伊枯草菌素a的产量，分析油料粕中矿物质在芽孢杆菌发酵生产伊枯草菌素a中的作用。

按上述方案，分别以油料粕或所述油料粕的提取蛋白作为氮源时，两者中的有效蛋白质含量相等，以便比较分析。其中，油料粕在培养基中的浓度为90-150g/l，油料粕提取蛋白在培养基中的浓度为40-60g/l。

按上述方案，所述碳源可以为葡萄糖、糖蜜、甘油、蔗糖或者玉米淀粉等，碳源在培养基中浓度为40-80g/l。

按上述方案，所述无机盐主要选择钾、磷、镁、锰等元素的无机盐。本发明中优选无机盐为k2hpo4·3h2o、mgso4·7h2o、mnso4·h2o的混合物，三者在培养基中浓度最优选为0.5g/lk2hpo4·3h2o,0.5g/lmgso4·7h2o,0.005g/lmnso4·h2o。

按上述方案，所述灭菌的条件为：121℃灭菌20-30分钟。

按上述方案，所述解淀粉芽孢杆菌cx-20(bacillusamyloliquefacienscx-20)，已于2018年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno：m2018794。

按上述方案，所述解淀粉芽孢杆菌的添加量为培养基总体积的4-6％。

按上述方案，所述发酵的条件为：利用气升式发酵罐在28-37℃进行搅拌并发酵36-72小时，期间无需补料，也无需改变发酵条件。

按上述方案，所述的油料粕主要包括菜粕、豆粕或者花生粕等。

按上述方案，所述油料粕蛋白提取的方法优选为碱溶酸沉法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种分析油料粕中矿物质在芽孢杆菌发酵生产伊枯草菌素a中作用的方法，虽然到目前为止还没有从油料粕中提取矿物质的方法，无法直接、单独分析这些矿物质的作用，但是本发明用两种方式从反面分析了油料粕中矿物质的作用，一种是通过添加额外的无机盐分析是否对油料粕作为氮源有抑制作用，毕竟在微生物发酵中，培养基中含有过量的无机盐会抑制微生物发酵，进而影响微生物代谢产物的产量；另一种是通过提取油料粕中蛋白，去除油料粕中的大部分矿物质，然后在不添加无机盐的情况下，分析油料粕提取蛋白作为氮源时是否会对微生物次级代谢产物有负面影响，因为在微生物发酵中，培养基中含有无机盐量过少时同样也会抑制微生物发酵，进而影响微生物代谢产物的产量。

(2)本发明通过技术方案分析出油料粕中矿物质在芽孢杆菌发酵生产伊枯草菌素a中的作用，即油料粕不仅可以作为氮源使用，其中的矿物质同样也可以代替微生物发酵所需的无机盐，虽然大部分研究者都认为油料粕中的矿物质有作用，但是到目前为止并没有直接证据表明这些矿物质对于微生物发酵的作用，因此本发明对提升油料粕在微生物发酵价值的认识方面具有重要作用。

附图说明

图1是本发明实施例解淀粉芽孢杆菌cx-20对不同氮源(菜粕、菜粕提取蛋白、蛋白胨、酵母粉和硝酸铵)在添加或不添加无机盐的情况下对iturina发酵的影响。

其中，各标号含义如下：1、90g/l培养基中加无机盐；2、90g/l菜粕培养基中不加无机盐；3、40g/l菜粕蛋白培养基中加无机盐；4：40g/l菜粕蛋白培养基中不加无机盐；5、22g/l蛋白胨培养基中加无机盐；6、22g/l蛋白胨培养基中不加无机盐；7、30g/l酵母粉培养基中加无机盐；8、30g/l酵母粉培养基中不加无机盐；9、8g/l硝酸铵培养基中加无机盐；10、8g/l硝酸铵培养基中不加无机盐。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，所采用的解淀粉芽孢杆菌cx-20(bacillusamyloliquefacienscx-20)，已于2018年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno：m2018794。

实施例

一种分析菜粕中矿物质在芽孢杆菌发酵产伊枯草菌素a作用的方法，该方法具体为：

(1)将菜粕、葡萄糖和水进行混合，最终使菜粕在水中的浓度为90g/l，葡萄糖的浓度为80g/l，在添加或不添加无机盐(0.5g/lk2hpo4·3h2o,0.5g/lmgso4·7h2o,0.005g/lmnso4·h2o)两种培养基中，121℃灭菌20分钟；待冷却后，按照发酵液体积的5％向其中加入解淀粉芽孢杆菌cx-20，然后在28℃、220rpm的条件下进行震荡培养，期间无需补料，也无需改变发酵条件；发酵72小时，测定发酵液中伊枯草菌素a的含量。

(2)利用碱溶酸沉的方法提取菜粕中的蛋白，将菜粕提取蛋白、葡萄糖和水进行混合，最终使菜粕提取蛋白在水中的浓度为40g/l(与上述步骤(1)中90g/l菜粕的蛋白质含量相等)，葡萄糖的浓度为80g/l，在添加或不添加无机盐(0.5g/lk2hpo4·3h2o,0.5g/lmgso4·7h2o,0.005g/lmnso4·h2o)两种培养基中，121℃灭菌20分钟；待冷却后，按照发酵液体积5％向其中加入解淀粉芽孢杆菌cx-20，然后在28℃、220rpm的条件下进行震荡培养，期间无需补料，也无需改变发酵条件；发酵72小时，测定发酵液中伊枯草菌素a的含量。

对比例

为了进一步判断无机盐是否对芽孢杆菌发酵产伊枯草菌素a有影响，本发明同样分析了另外三种氮源，包括蛋白胨(动物来源)、酵母粉(植物来源)和硝酸铵(无机氮)，在最适的浓度下(分别为22g/l、30g/l、8g/l)，无机盐的添加与否对伊枯草菌素a产量的影响。对比例其他条件均与实施例相同，不同之处仅在于氮源以及氮源的浓度不同。

如图1所示，相对于添加无机盐的情况下iturina的产量，在不添加无机盐的情况下，在对比例这三种氮源中iturina的产量都明显降低：其中在蛋白胨作为氮源的培养基中，iturina的产量由1.07g/l降低到了0.05g/l；在酵母粉作为氮源的培养基中，iturina的产量由0.56g/l降低到了0.23g/l；在硝酸铵作为氮源的培养基中，iturina的产量由0.05g/l降低到了0g/l。

同样地，以菜粕提取蛋白作为氮源时，无机盐的不添加同样也使iturina的产量由1.48g/l降低到了0.24g/l。但是，当以菜粕作为氮源时，添加无机盐时iturina的产量为1.15g/l，而不添加无机盐时iturina的产量反而升高到了1.25g/l。

因此，以菜粕作为氮源时，在不添加无机盐的条件下，解淀粉芽孢杆菌产伊枯草菌素a的量更高；而在菜粕提取蛋白作为氮源时，在不添加无机盐的情况下，解淀粉芽孢杆菌产伊枯草菌素a的量显著降低；综合这两个结果明显证明菜粕中矿物质在芽孢杆菌发酵产伊枯草菌素a具有促进作用，可以行使微生物培养基中无机盐作用。利用本发明该方法不仅能分析菜粕中矿物质在芽孢杆菌发酵产伊枯草菌素a的作用，还可以分析其他油料饼粕等含有不同组分的农副产物中矿物质在其它微生物代谢产物中的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。