aH 2P04溶液按照体积比4:1组成的混合溶液为电解液，在-1.1V 恒电位下，电化学还原 7s (1-l)、15s (1-2),22s (1-3),30s (1-4),45s (1-5),60s (1-6);电化学还原反应结束后，将基底用丙酮浸泡2h，去除光刻胶，得到石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极。
[0022]用显微镜观察步骤5得到的1-1、1-2、1-3、1_4、1_5、1-6样品，如图3所示，由图可知，当还原时间为7s时，石墨烯阵列为20 μ m的圆盘，间距60 μ m,阵列尺寸均一完整，随着还原时间的增加，石墨烯半径不断增大。图4为步骤5得到的11-1、I1-4样品的红外光谱曲线，数据显示氧化石墨烯上的C=O (1731 cnTOX-OH (1224 cnT1)以及C-O-C峰(1065CnT1)在还原7s后消失，说明氧化石墨烯被还原。然后随着还原时间的增加，基团峰变化不明显，说明还原7s时就可以得到石墨烯。
[0023]实施例2:将实施例1制备的石墨烯/氧化石墨烯阵列电极用于双氧水浓度的测定。
[0024]图5为不同还原时间的石墨烯/氧化石墨烯阵列(如图3所示)在1mM双氧水中催化电流密度曲线，从图中可以看出，还原30s的样品1-4的电催化双氧水分解的能力最强，因此本实施例采用样品1-4来测定未知双氧水的浓度。
[0025]以样品1-4为工作电极、银/氯化银电极作为参比电极、钼片电极作为对电极，组成三电极系统；测定双氧水浓度时，将三电极系统置于盛有30ml浓度为0.1M的似2即04溶液和浓度为0.1M的NaH2PCV^液按照体积比4:1组成的混合溶液的烧杯中，然后在工作电极上施加0.6V恒电压，记录电流一时间曲线，当背景电流达到稳定后，每隔50s往溶液中加入34 μ L双氧水溶液(浓度如图6所示)，通过测定不同浓度的双氧水的响应电流，得到电流一时间曲线，如图6所示。根据图6的数据，可进一步得到图7所示的电流一溶度曲线。由图7可知，响应电流与双氧水浓度符合线性回归方程J=1.5+26.7C，方差为0.990 ;其中J为响应电流密度值，单位是nAmm2，C为浓度，单位是mM。由此可知，C = (J-1.5)/26.7。
[0026]实施例3:将实施例1制备的石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极1-4用于神经细胞的培养以及细胞分泌双氧水的测定。
[0027]将还样品1-4灭菌后接种神经细胞PC12，接种密度3000个/mL，在含有10%胎牛血清、1%双抗的培养基中培养24h。通过免疫荧光双染细胞的肌动蛋白与细胞核观察细胞的生长状态，其中，采用Act1-Stain Phalloidin染细胞的F-actin蛋白，DAPI染细胞核。在细胞分泌双氧水检测时，石墨烯/氧化石墨烯阵列接种细胞培养24h后作为工作电极、银/氯化银电极作为参比电极、钼片电极作为对电极，组成三电极系统置于盛有30ml浓度为0.2M的Na2HPO4溶液和0.2M的NaH丨04溶液按照体积比4:1组成的混合溶液的烧杯中，然后在工作电极上施加0.6V恒电压，当背景电流达到稳定后，向工作电极注射10 μ L浓度为10nM的12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(ΡΜΑ)，记录电流一时间曲线。对照组未接种细胞，其他操作与实验组相同。
[0028]按照上述方法，将石墨烯/氧化石墨烯微阵列用于神经细胞的培养以及细胞分泌双氧水的测定。图8是本发明制备的石墨烯/氧化石墨烯微阵列接种神经细胞的荧光显微镜图片。可以看出细胞多数分布在氧化石墨烯上，生长状态良好，细胞触角多固定在石墨烯与氧化石墨烯的界面上，有利于细胞分泌的双氧水扩散到石墨烯上。由于细胞接种在阵列电极上，细胞分泌的双氧水直接被催化分解，可以根据J=1.5+26.7C，直接计算细胞分泌的双氧水浓度，不需要进一步计算。图9是本发明石墨烯/氧化石墨烯微阵列接种神经细胞PC12后在0.1M的Na2HPO4溶液和0.1M的NaH丨04溶液按照体积比4:1组成的混合溶液中，用10 μ L浓度为10nM的PMA刺激细胞分泌双氧水，得到的计时安培曲线。其中a曲线为对照组，药物PMA刺激未接种细胞的阵列电极；b曲线为实验组，药物PMA刺激接种细胞的阵列电极。图中看出，PMA刺激实验组时，瞬间产生响应电流，而且很快电流很快恢复初始位置，说明分泌的双氧水很快被催化分解。第一次PMA刺激的响应电流密度为3.9nAmm 2，根据实施例2得到的线性回归方程，计算得到细胞分泌的双氧水的浓度大小为0.15mM。由此可知，本发明方法制备的石墨烯/氧化石墨烯微阵列制备方法简单、重复性高、成本较低。用于双氧水传感器能够稳定、准确、快速、灵敏地检测双氧水的浓度，其检测限达~200nM，与大多数报道的贵金属催化剂的双氧水传感器相当。尤其在用于细胞传感器方面，表现出良好的生物活性以及较高的灵敏度，具有很大的开发价值。
【主权项】
1.一种石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极，其特征在于，由ITO玻璃(I)和沉积于ITO玻璃(I)上的导电层构成，所述导电层由氧化石墨烯(2)和嵌于氧化石墨烯(2)中有序排列RGO阵列(3)组成。
2.—种权利要求1所述的石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采用光刻技术在ITO玻璃上构建阵列图案，具体为:将正性光刻胶旋涂于ITO玻璃上，涂胶转速为5000rpm，旋涂时间1s ;旋涂后，将ITO玻璃在100°C下烘90s，得到光刻层；然后将光刻模板置于光刻层上，紫外曝光60s ;曝光后在10(TC下烘90s，最后显影24s ;所述光刻模板具有有序排列的图形； (2)将浓度为4mg/mL的氧化石墨烯水溶液进一步旋涂于步骤I制备的基底上，转速3000 rpm，旋涂时间30s ； (3)以步骤2处理后的基底作为工作电极，银/氯化银电极为参比电极，钼片为对电极，以0.2M的Na2HPO4溶液和0.2M的NaH孑04溶液按照体积比4:1组成的混合溶液为电解液，在-1.1V恒电位下，电化学还原7~60s ;电化学还原反应结束后，将基底用丙酮浸泡2h，去除光刻胶，得到石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极。
3.—种权利要求1所述的石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极的应用，其特征在于，该应用为:将石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极用于检测双氧水溶液的浓度。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:将石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极用于检测双氧水溶液的浓度，具体为:将权利要求1所述的石墨烯/氧化石墨烯微阵列为工作电极、银/氯化银电极作为参比电极、钼片电极作为对电极，组成三电极系统，测定待测双氧水溶液试样的电流响应值J，C =CJ-L 5)/26.7 ;其中，J为电流密度响应值，C浓度值。
5.一种权利要求1所述的石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极的应用，其特征在于，该应用为:将石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极用于检测细胞分泌的双氧水的浓度。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:将石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极用于检测细胞分泌的双氧水的浓度，具体为:将细胞接种于的石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极上，以接种后的石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极为工作电极、银/氯化银电极作为参比电极、钼片电极作为对电极，以PBS溶液为电解液；用PMA刺激工作电极上的细胞产生分泌双氧水，测定电流响应值J ;根据C =CJ-L 5)/26.7，计算细胞分泌双氧水的浓度；其中，J为电流密度响应值，C浓度值。
【专利摘要】本发明公开了一种石墨烯/氧化石墨烯微阵列的制备方法以及将其作为化学与细胞传感器的应用。本发明主要是将微加工技术与电化学方法结合，在ITO玻璃基底上制备了石墨烯/氧化石墨烯微阵列电极。利用本发明制备的微电极对双氧水的电化学催化氧化作用，采用计时安培法实现了对双氧水的体外及活体的定量分析及检测。制备方法简单易行、灵敏度高、响应时间短、生物相容性好，能够快速检测双氧水的浓度。
【IPC分类】G01N27-30, G01N27-413
【公开号】CN104655698
【申请号】CN201510080785
【发明人】刘爱萍, 赵明, 徐盼举
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月15日