染色来确定。这些结果表明与非肿瘤性肝脏部分相比，hCEl的表达水平在肿瘤性肝脏部分中明确地降低。
[0036]图6是示出通过Nano-LC-MS/MS系统鉴定的健康志愿者和患有HCC的病人血浆中的hCEl的胰蛋白酶肽的表格，使用该表格证实人血浆中的hCEl的存在。
[0037]图7是图6中示出的共同肽的代表性Nano-LC-MS/MS色谱图。
[0038]图8是示出在免疫沉淀之后使用蛋白质印记分析确定的有代表性的三名健康志愿者与三名患有HCC的病人之间的hCEl水平的差异的照片。
[0039]Np:健康志愿者的血浆
[0040]Tp:患有HCC的病人的血浆
[0041]图9是比较八名健康志愿者与八名患有HCC的病人的血浆中的hCEl水平的图表。
【具体实施方式】
[0042]在下面的实施例中详细描述本发明。所包括的实施例仅为描述本发明，然而，本发明的范围不局限于实施例。
[0043]实施例1:临床组织和血浆的收集
[0044]患有HCC的病人的非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织以及个体病理信息从延世大学医学院(韩国首尔)的病理学系获得。使用下面的化验物来评估来自健康志愿者的血浆作为阴性对照的适当性:源自HIV的HIV-1抗体和HIV-2抗体，是表征肝癌的标准测试成分；HIV-1抗原；乙型肝炎表面抗原；乙型肝炎核心抗原；丙型肝炎病毒汀细胞白血病病毒(HTLV-1/II)抗原；以及苍白螺旋体。根据人类蛋白质组组织(HUPO)正式采用的标准化的样品分离方法来获得血浆。
[0045]将来自男性或女性的每种血液样品(4ml)在含有乙二胺四乙酸二钾(K2EDTA)的试管中在室温下保持30分钟，接下来以2，400Xg离心15分钟。保留上清物(血浆)。将非肿瘤性肝组织、肿瘤性肝组织和血浆样品以_70°C保存直到准备使用。肝组织和血浆在取得病人知情同意的情况下根据延世大学医学院的伦理委员会(IRB)的批准程序获得。
[0046]实施例2:非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织中的糖蛋白的分离
[0047]在RIPA 缓冲液(50mM Tris, 150mM NaCl, 1% 乙基苯基聚乙二醇(NonidetP-40)，0.25%脱氧胆酸钠，pH 7.4)中以4°C将每种组织的10mg样品进行均质化。使用五种不同的琼脂糖结合血凝素的混合物通过血凝素亲和色谱将糖蛋白分离，五种不同的琼脂糖结合血凝素是:伴刀豆球蛋白A、麦胚凝集素、榴莲凝素(Jacalin)、接骨木提取物(Sambucus nigra)和橙黄网孢盘菌提取物(Aleuria aurantia)。将对于具有不同的糖组成的糖蛋白有着结合特异性的血凝素混合物装入2mlPD-10柱(Pierce)中。将含有糖蛋白的样品施加到结合缓冲液(20mM Tris, ImM MnCl2, ImM CaCl2, 0.15M NaCl, pH7.4)中的柱，并使所述样品与柱相互作用30分钟。
[0048]将结合的糖蛋白用缓冲液(0.2M甲基-D-吡喃甘露糖苷，0.2M甲基-D-吡喃葡萄糖苷，0.2M N-乙酰葡糖胺，0.2M半乳糖，0.1M乳糖，0.1M海藻糖，20mM Tris,0.5MNaCl, pH 7.0)洗脱，该缓冲液基于糖组成转移糖蛋白。使用5_kDa的膜滤器将洗脱的糖蛋白浓缩，并用50%三氯乙酸和100%冰冷的丙酮沉淀。将沉淀物溶解在2D裂解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS, 30mM Tris, pH 8.5)中，并且将得到的蛋白溶液调整至pH8.5。使用2D Quant (GE Healthcare)试剂盒测定蛋白的浓度。
[0049]实施例3:双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)
[0050]使用来自五名病人的十个成对的样品(五个来自非肿瘤性肝组织，五个来自肿瘤性肝组织)来准备用于2-D DIGE的分析样品(每份50 μ g)。对分析样品和相应的合并标准样品的每个用焚光染料Cy3、Cy5和Cy2 (400pmol ；GE Healthcare)在黑暗条件下标记30分钟。
[0051]通过加入I μ IlOmM赖氨酸使反应终止，并将三种标记的样品混合，通过加入样品缓冲液(6Μ尿素，2Μ硫脲，4% CHAPS, 60mM 二硫苏糖醇(DTT)，30mM Tris, pH 8.5)将样品的终体积调节到450 μ I并通过用2% IPG3-10NL缓冲溶液在室温下培育16小时而再水化。
[0052]使用Immobiline DryStrip pH 3-10NL 在 MultiPhor II 型电泳系统(GEHealthcare)上以最佳条件(达95，000V)执行等电聚焦(IEF)，然后进行一步法还原和烷基化，其中，DryStrip在三丁基膦(TBP)缓冲溶液(6M尿素，2 %十二烷基硫酸钠(SDS), 30mM Tris, 20%甘油，2.5%丙烯酰胺溶液，5mM TBP)中培育25分钟。
[0053]在还原和烧基化之后，使用Ettan Dalt-twelve电泳系统(GE Healthcare)通过在9%至16%梯度的聚丙烯酰胺凝胶上的电泳对等电聚焦的蛋白进行第二向分离。然后，使用Typhoon 9400扫描仪(GE Healthcare)以与Cy2、Cy3和Cy5对应的波长对每块凝胶进行扫描，并且使用Decyder 2_D分析软件(GE Healthcare)分析每块凝胶的图像。
[0054]实施例4:2-D DIGE分离的蛋白的鉴定
[0055]在进行图像分析之后，将与显著差异表达的蛋白对应的点从考马斯亮蓝染色的凝胶上切下、脱色并用胰蛋白酶消化。使用Poros R2和Oligo R3树脂混合物对消化的肽进行脱盐。使用4800MALD1-T0F-MS(Applied B1system)来分析蛋白并使用MASCOT数据库对图谱进行鉴定。
[0056]实施例5:通过蛋白质印记分析对组织中的HCC生物标记物表达水平进行验证
[0057]通过蛋白质印记分析验证了来自十名病人的非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织之间的HCC生物标记物蛋白浓度的差异。将来自每种样品的等量(5yg)的蛋白在10%的凝胶上通过SDS-PAGE分离。
[0058]然后，将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜，通过在含有5%脱脂乳的TBS-T缓冲液(20mM Tris, 137mM NaCl，0.1 %吐温-20，pH 7.6)中以室温培育I小时而对蛋白进行封闭。然后，将所述膜与抗hCEl的一抗(CEl，Abcam;以1:10000存在于TBS-T/5%脱脂乳中)在室温下一起培育I小时。使用小鼠抗β-actin (Santa Cruz)作为阳性对照。
[0059]在使用TBS-T/5%脱脂乳洗涤之后，将所述膜与辣根过氧化物酶(HRP)耦联的抗兔IgG的二抗(Santa Cruz ;以1:20000稀释)以室温一起培育I小时。使用ECL Plus蛋白质印记试剂(GE Healthcare)检测免疫反应的蛋白，使用Typhoon 9400扫描仪对点进行扫描及分析。
[0060]实施例6:使用免疫组化染色方法验证组织中HCC生物标记物表达水平
[0061]将通过来自患有HCC的47名病人的非肿瘤性肝部分和肿瘤性肝部分的成对的组织构建的石蜡包埋的组织阵列用于免疫组化。使用二甲苯和乙醇对载片进行脱蜡，水化，然后用0.6%过氧化氢进行处理。将抗hCEl的抗体(1: 100)施加到载片并培育30分钟。使用ChemMate Envis1n试剂盒(DAKO)使hCEl结合抗体颜色显示出来并使用苏木精(用作对照染色剂)染色30秒。染色的强度得分为I) 未染色;2) “ + ”，弱染色；以及3) “++”，强染色。
[0062]实施例7:通过免疫沉淀和蛋白质印记分析验证人血浆中HCC生物标记物蛋白分泌水平
[0063]按照制造商的描述，用抗hCEl的抗体包被Dynabead MyOne?Tosylactivated (Invitrogen)磁珠。简单来说，将磁珠(1mg)和抗hCE