l的抗体(400 μ g)混合并在结合缓冲液(0.1M硼酸钠，IM硫酸胺，pH 9.5)中以37°C培育16小时，然后用TBS_T/5%脱脂乳封闭额外的16小时。通过将抗体包被的珠子(500 μ g)转移到含有8mg血楽的Iml试管中并培育2小时而将hCEl从健康志愿者和患有HCC的病人的血浆中免疫沉淀出来。
[0064]通过将TBS-T缓冲液的pH调整至pH2来洗脱抗体结合的蛋白。通过使用如在实施例5中描述的抗hCEl的一抗(Abeam ;1:1000)和辣根过氧化物酶(HRP)耦联的抗兔IgG的二抗(Santa Cruz ；1:5000)的蛋白质印记分析来确定健康志愿者和患有HCC的病人的血浆之间的hCEl水平差异。
[0065]实施例8:通过Nano-LC-MS/MS系统验证人血浆中的hCEl蛋白
[0066]将基于蛋白质印记分析(实施例7)与hCEl对应的条带从凝胶切下来，并通过二硫苏糖醇(DTT)/碘乙酸(IAA)处理来还原并烷基化。在用胰蛋白酶消化来获得肽之后，使用Nano-LC-MS/MS系统和四极杆线性离子阱(LTQ)检测器来对将凝胶-分离的蛋白鉴定为hCEl的结论进行验证。
[0067]产业上的可利用性
[0068]如上所述，发现hCEl是一种用于HCC诊断的新的生物标记物。根据本发明，血浆中的hCEl蛋白分泌水平可以用作进行HCC早期诊断的指标，从而有助于通过实施及时的治疗干涉来增大患有HCC的病人的存活率。
【主权项】
1.人肝羧酸酯酶I蛋白在制备用于诊断主体中的肝癌的组合物中的应用，所述诊断包括: 检测来自主体的血液样品中作为用于肝癌诊断的血浆生物标记物的人肝羧酸酯酶I蛋白的存在， 其中，患有肝癌的主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平增加为高于健康主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，患有肝癌的主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平与健康主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平相比平均增加到2倍至5倍。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，用抗人肝羧酸酯酶I的抗体检测人肝羧酸酯酶I蛋白的存在。
4.人肝羧酸酯酶I蛋白在制备用于诊断主体中的肝癌的组合物中的应用，所述诊断包括下述步骤: (a)将来自主体的血液样品的一部分与对人肝羧酸酯酶I蛋白具有特异性亲合力的抗体接触，从而形成所述抗体与人肝羧酸酯酶I蛋白之间的复合体，所述抗体具有可检测到的标记； (b)将所述接触步骤(a)中形成的复合体与不包括所述复合体的标记抗体分离； (C)对来自包括所述接触步骤(a)中形成的复合体的抗体的可检测到的标记的信号进行量化，所述信号与血液样品中的人肝羧酸酯酶I蛋白的量成比例，由此计算出样品中人肝羧酸酯酶I蛋白的量； (d)将所述量化步骤(C)中计算出的人肝羧酸酯酶I蛋白的量与人肝羧酸酯酶I蛋白参考量进行比较；以及 (e)当所述量化步骤(C)中计算出的样品中的人肝羧酸酯酶I蛋白的量大于人肝羧酸酯酶I蛋白参考量时，提供所述主体中的肝癌的诊断。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，人肝羧酸酯酶I蛋白参考量是来自不患有肝癌的主体的血液样品中的人肝羧酸酯酶I蛋白的量。
6.根据权利要求4所述的应用，其中，血液样品包括血浆。
7.根据权利要求4所述的应用，其中，血液样品包括血清。
8.根据权利要求4所述的应用，其中，所述诊断还包括将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离的步骤，其中，分离人肝羧酸酯酶I蛋白的步骤在步骤(a)与步骤(b)之间进行。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，通过免疫沉淀将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离。
10.根据权利要求8所述的应用，其中，将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离的步骤包括以下步骤: (i)将来自主体的血液样品的一部分与对人肝羧酸酯酶I蛋白具有特异性亲合力的抗体接触，从而形成所述抗体与人肝羧酸酯酶I蛋白之间的复合体； (ii)使接触步骤⑴中形成的复合体沉淀；以及 (iii)将沉淀的复合体与样品的上清物分离，上清物包括其他剩余的蛋白和不包括所述复合体的抗体， 由此，将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述抗体连接到磁性分子。
12.抗人肝羧酸酯酶I的抗体在制备用于诊断主体中的肝癌的组合物中的应用，所述诊断包括: 用抗人肝羧酸酯酶I的抗体检测来自主体的血液样品中作为用于肝癌诊断的血浆生物标记物的人肝羧酸酯酶I蛋白的存在， 其中，患有肝癌的主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平增加为高于健康主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，患有肝癌的主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平与健康主体的血浆中的人肝羧酸酯酶I蛋白的水平相比平均增加到2倍至5倍。
14.抗人肝羧酸酯酶I的抗体在制备用于诊断主体中的肝癌的组合物中的应用，所述诊断包括下述步骤: (a)将来自主体的血液样品的一部分与对人肝羧酸酯酶I蛋白具有特异性亲合力的抗人肝羧酸酯酶I的抗体接触，从而形成所述抗体与人肝羧酸酯酶I蛋白之间的复合体，所述抗体具有可检测到的标记； (b)将所述接触步骤(a)中形成的复合体与不包括所述复合体的标记抗体分离； (C)对来自包括所述接触步骤(a)中形成的复合体的抗体的可检测到的标记的信号进行量化，所述信号与血液样品中的人肝羧酸酯酶I蛋白的量成比例，由此计算出样品中人肝羧酸酯酶I蛋白的量； (d)将所述量化步骤(C)中计算出的人肝羧酸酯酶I蛋白的量与人肝羧酸酯酶I蛋白参考量进行比较；以及 (e)当所述量化步骤(C)中计算出的样品中的人肝羧酸酯酶I蛋白的量大于人肝羧酸酯酶I蛋白参考量时，提供所述主体中的肝癌的诊断。
15.根据权利要求14所述的应用，其中，人肝羧酸酯酶I蛋白参考量是来自不患有肝癌的主体的血液样品中的人肝羧酸酯酶I蛋白的量。
16.根据权利要求14所述的应用，其中，血液样品包括血浆。
17.根据权利要求14所述的应用，其中，血液样品包括血清。
18.根据权利要求14所述的应用，其中，所述诊断还包括将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离的步骤，其中，分离人肝羧酸酯酶I蛋白的步骤在步骤(a)与步骤(b)之间进行。
19.根据权利要求18所述的应用，其中，通过免疫沉淀将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离。
20.根据权利要求18所述的应用，其中，将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离的步骤包括以下步骤: (i)将来自主体的血液样品的一部分与对人肝羧酸酯酶I蛋白具有特异性亲合力的抗人肝羧酸酯酶I的抗体接触，从而形成所述抗体与人肝羧酸酯酶I蛋白之间的复合体； (ii)使接触步骤(i)中形成的复合体沉淀； (iii)将沉淀的复合体与样品的上清物分离，上清物包括其他剩余的蛋白和不包括所述复合体的抗体，由此，将人肝羧酸酯酶I蛋白与血液样品中其他剩余的蛋白分离。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述抗体连接到磁性分子。
【专利摘要】提供了hCE1及其抗体在制备用于诊断主体中肝癌的组合物中的应用。在所述hCE1在制备用于诊断主体中的肝癌的组合物中的应用中，所述诊断包括：检测来自主体的血液样品中作为用于肝癌诊断的血浆生物标记物的人肝羧酸酯酶1蛋白的存在，其中，患有肝癌的主体的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平增加为高于健康主体的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104749380
【申请号】CN201510136986
【发明人】白融基, 罗根
【申请人】延世大学校产学协力团
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2008年10月1日
【公告号】CN102027127A, US8198038, US20110097738, WO2009113758A1