一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] 卵巢早衰是指女性在40周岁以前，除妊娠外，由某种原因导致的闭经，以血清雌激 素水平下降、促性腺激素水平升高为特征的疾病。据流行病学统计提示，女性40岁以前的发 病率为1 %，原发性必经中卵巢早衰占 I〇 %~28 %，继发性闭经中卵巢早衰占4%~18 %，且 发病率呈逐年上升的趋势。卵巢早衰已成为当今妇女不孕症的主要病因之一，严重影响患 者生活质量、增加社会经济负担。对于卵巢早衰的病因及发病机制较为复杂，尚不十分清 楚。卵巢早衰的治疗主要采用激素治疗，但是有临床研究发现，以激素治疗卵巢早衰会增加 乳腺癌、子宫内膜癌以及心血管疾患、中风的发病率。
[0003] 近年来间充质干细胞移植治疗成为临床研究的热点，为卵巢早衰的临床治疗提供 新的希望，并取得初步的疗效。目前虽然已有用骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞治疗 卵巢早衰的报道，并取得一定的疗效，但是需要经过骨穿刺才能获取骨髓，对机体造成较大 的身体创伤，同时骨髓含有复杂的细胞成分，干细胞在其中的含量较低，需要较长时间的扩 增，并不是比较好的种子细胞;脐带干细胞虽然免疫原性低，但是如果早期没有储存间充质 干细胞，只能采用异体干细胞移植，存在一定的风险。
[0004] 近年来，日本科学家在女性经血中发现了具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞 可用于修复受损的心肌组织。2008年，美国科学家Patel等发现，从健康女性经血中可分离 出来间充质干细胞，这些细胞具有多向分化能力，并将该细胞命名为经血源子宫内膜干细 胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells ,MenSCs) aMenSCs属于成体干细 胞的一种，具有来源丰富、有效成分含量丰富、收集过程无创、增殖和分化潜能巨大、无伦理 争论及废物回收利用等优点。同时，研究表明，宫内膜干细胞可以用于治疗卵巢早衰、子宫 内膜疾病、预防衰老等功能，有望成为较为理想的种子细胞。但目前并未见关于经血源干细 胞制剂的报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种经血源干细胞制剂及其制备方 法与应用，本发明提供的经血源干细胞制剂干细胞存活率高，性质稳定，对卵巢早衰的治疗 效果良好。
[0006] 本发明提供的经血源干细胞制剂包括:经血源干细胞、白蛋白和生理盐水。
[0007] 生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相 等的氯化钠溶液。本发明采用的生理盐水是指质量分数为0.9%的氯化钠溶液，其与人体组 织的渗透压一致，以其作为溶剂，不会对经血源干细胞产生损伤。
[0008]白蛋白（又称清蛋白，albumin，Alb)是血衆中含量最多的蛋白质，占血衆总蛋白的 40%~60%。能够维持血浆胶体渗透压的恒定且承担一定的运输功能。以往的研究中表明， 白蛋白可能会诱导干细胞的分化。但本发明通过实验证实，在经血源干细胞制剂中添加白 蛋白可以为经血源干细胞提供营养，提高经血源干细胞在制剂中的存活率，且经血源干细 胞制剂在低温保藏一个月后仍未见分化的迹象。
[0009] 在一些实施例中，其中所述白蛋白的质量分数为1%~5%。
[0010] 在一些实施例中，其中所述白蛋白的质量分数为3%。
[0011] 在一些实施例中，其中所述白蛋白为人血清白蛋白。
[0012] 在一定范围内，白蛋白的添加量与经血源干细胞的存活率成正相关。但过高的白 蛋白浓度会导致细胞因渗透压失衡而失水变形，反而降低经血源干细胞的存活率。实验表 明，制剂中添加白蛋白的质量分数为1 %~5%最有利于提尚细胞存活率。
[0013] 在本发明的实施例中，其中所述经血源干细胞的密度为1〇4个/mL~IO5个/mL。
[0014] 在一些实施例中，其中所述经血源干细胞的密度为IO4个/mL。
[0015] 在一些实施例中，其中所述经血源干细胞的密度为IO5个/mL。
[0016] 制剂中，干细胞密度过大则存活率会因营养不足而大幅降低，而干细胞密度过小 也不利于存活率的保持，且过小的干细胞密度会导致用所需制剂量的增大。本发明通过实 验证实，干细胞密度为IO 4个/mL~IO5个/mL时，干细胞存活率最高。
[0017] 在一些实施例中，所述经血源干细胞的制备方法包括：
[0018] 步骤1:以PBS稀释经血后，分离单个核细胞，以PBS清洗后，接种至无血清培养基； [0019] 步骤2:37°C，体积分数为5%的⑶2，培养48h后，半量换液，72h后全量换液，之后每 3天全量换液1次，直至细胞生长至70 %~80 %汇合，传代。
[0020] 在一些实施例中，无血清培养基为Lonza无血清培养基。
[0021] 经血源干细胞分离自女性经血，来源丰富，且属于废物利用，很好的解决了脐带干 细胞或其他干细胞存在的伦理问题。经血源干细胞的分离方法对其细胞活性的影响很大， 本申请采用的制备方法能够最大限度的保护经血源干细胞的活性。
[0022] 作为优选，PBS稀释经血时，PBS与经血的体积比为1:1。
[0023] 作为优选，Ficoll分离液与经血的体积比为1:1。
[0024]作为优选，单个核细胞的分离方式为离心分离，具体为，700g离心15min后，转移上 清液，以PBS清洗2次后，再次离心取细胞沉淀，接种至无血清培养基。
[0025] 作为优选，接种的密度为7 X IO5CelΙ/mL~8 X 105cel 1/mL。
[0026] 作为优选，传代具体为：以胰蛋白酶消化后，悬浮细胞接种于无血清培养基，继续 培养。
[0027] 在一些实施例中，经血源干细胞为为第3代~第5代的经血源干细胞。
[0028] 第3代~第5代的经血源干细胞能够保持干细胞固有的分化潜能，不会出细胞凋亡 或衰退的现象，其状态最佳，在适当的条件下，可以迅速增长并分化。
[0029]本发明提供的经血源干细胞制剂的制备方法，包括:将白蛋白与生理盐水混合后， 重悬经血源干细胞，获得经血源干细胞制剂。
[0030]本发明提供的经血源干细胞制剂能够很好的维持经血源干细胞的活性和存活率， 在保存期间不会发生分化，因此，本发明提供的经血源干细胞制剂可以用于制备治疗卵巢 早衰的药物。
[0031]本发明提供的经血源干细胞制剂在制备治疗卵巢早衰的药物中的应用。
[0032]在一些实施例中，经血源干细胞制剂治疗卵巢早衰的剂量为0.2mL/次~0.4mL/ 次。
[0033]在一些实施例中，经血源干细胞制剂治疗卵巢早衰的方法为注射，具体为0.2mL/ 次~0.4mL/次，注射的次数为2次，每日一次。
[0034] 本发明提供的经血源干细胞制剂，包括:经血源干细胞、白蛋白和生理盐水。本发 明提供的经血源干细胞制剂中，经血源干细胞在白蛋白及生理盐水的保护下，能够维持良 好的存活率和活性，且不会启动分化。实验表明，本发明提供的经血源干细胞制剂能够将经 血源干细胞的存活率维持在99%以上，细胞大小均匀、形态均为梭型。(TC~4°C保存1个月 后，细胞仍保持着良好的形态，没有出现体积变大等异常现象，存活率仍保持在95%以上， 且经表面抗原检测，经血源干细胞仍保持干细胞的特点，没有发生分化，具有良好的活性。 以本申请提供的经血源干细胞制剂用于治疗卵巢早衰能够具有良好的治疗效果，使用本发 明提供的经血源干细胞制剂一周后，小鼠卵泡数量显著(P〈〇.05)增加。
【附图说明】
[0035]图1示原代培养7天的经血源干细胞，40 X ;
[0036] 图2示原代培养7天的经血源干细胞，100X。
【具体实施方式】
[0037] 本发明提供了一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用，本领域技术人员可以 借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领 域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通 过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的 方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0038] 本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0039] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0040] 实施例1
[0041] 取经检验合格的经血，用相同体积的PBS溶液稀释经血形成经血稀释液;取隔层离 心管，加入经血稀释液一半体积的F i c 〇 11分离液，缓慢加入经血稀释液，之后7 0 0 g离心 15min;将上层溶液移至另一个新的离心管中，PBS清洗2遍，用无血清培养基重悬离心后沉 淀，调整接种密度为7~8X 105/ml，接种至培养皿中，十字混匀后放于二氧化碳培养箱中培