专利名称：一种植物内生枯草芽孢杆菌及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其制剂，特别是一种植物内生枯草芽孢杆菌及其制剂。
背景技术：
随着科技的发展和生活水平的提高，人们对绿色食品、限制使用化学农药和环境保护的要求也不断提高。枯草芽孢杆菌是自然界普遍存在的、对人畜无毒无害、不污染环境、对许多植物病害有良好防治效果的非致病细菌，作为一种防病微生物，枯草芽孢杆菌正日益受到人们的重视，有不少相关的研究报道。如《生物防治通报》1993.9(2)63-68发表了王雅平、刘伊强等的文章“枯草芽孢杆菌TG26防病增产效应研究”，报道了分离自丝瓜根部的一株枯草芽孢杆菌TG26菌株室内盆栽对小麦赤霉病的防病效果为82.25-89.80％，浸根处理对西瓜枯萎病和青枯病的防效达100％，田间小区防效对小麦赤霉病、西瓜枯萎病和青枯病的防效分别为76.4％、73.1％和79.6％，并有明显的增产效应。申请号为99114260.8的发明专利“枯草芽孢杆菌菌剂、制法及其使用方法”，介绍了一种枯草芽孢杆菌菌剂、制法及其使用方法，菌剂含有菜丰宁B1菌株、菜丰宁B2菌株、麦丰宁B3菌株总量为5亿/克以上。申请号为98124889.6的发明专利“一种枯草芽孢杆菌菌株、制法、制剂及应用”，介绍了一种枯草芽孢杆菌菌株、制法、制剂及应用，菌株来源于苹果果实表面，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，编号为XM16，菌种保藏编号为CGMCC No.0372；以蛋白质、淀粉和蔗糖为主要原料，进行分离培养和菌体生产，用于苹果霉心病和枝干病害等作物真菌病害的防治。以上的枯草芽孢杆菌都具有抑菌和防病作用，但它们都是非植物体内生的枯草芽孢杆菌。实验表明，非内生枯草芽孢杆菌易受外界环境的影响，且易被大田中的其它微生物抑制，严重影响其对植物病害的防治效果。用于室内盆栽尚可，用于防治大田作物病害的效果极差。
植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物。植物内生细菌至今已有100多年的研究历史。目前已对50多种植物的内生细菌进行了分离，分离到包括格兰氏阴性菌和格兰氏阳性菌共计50多个属，几乎所有的健康植株均可分离到内生细菌。研究还表明，植物内生细菌不仅将寄主植物作为其栖息场所，而且对寄主植物具有促生、防病、固氮等生物学作用，同时内生细菌还是外源基因导入植物体内的良好载体。
有关植物内生细菌具有促生、防病、固氮等作用的报道较多。如《中国生物防治》1996，12(1)7-10发表了夏正俊，顾本康等的文章“棉花内生及根际土壤细菌诱导棉花对大丽轮枝菌抗性的研究”，报道了从棉花组织内分离到294株细菌，6.8％的菌株对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)有较强的拮抗作用，其中73a菌株对病害表现出67.21％诱导抗性作用。Sturz A.V.，Christie B.R.和Nowak J.发表的Baterial endophytesPotential role in developingsustainable systems of crop production.《Critical Reviews inPlant Sciences》.2000，19(1)1-30.综合报道了近年来植物内生细菌在促生、防病、固氮等方面的效果，受到开发研究人员的亲睐。
在微生物制剂的生产方面，传统的生物农药工业生产工艺是砂土管菌种→斜面活化→摇瓶考察→种子罐培养→发酵罐培养→过滤浓缩→吸附→喷雾干燥→质量检验→包装→成品入库。
三、技术内容本发明的目的是开发一种能够在植物体内定殖传导、对植物病原真菌具有较强拮抗作用、且同时具有促生作用的枯草芽孢杆菌制剂。
本发明的一种植物内生枯草芽孢杆菌及其制剂，菌株是从辣椒叶片内分离，经人工诱变筛选，获得能在多种植物体内内生定殖传导的植物内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis，已于2002年10月14日送交位于北京市中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0819)。其特征是，用抗利福平与拮抗植物病原真菌双标记进行内生测定，从植株体内回收分离的菌株，在含利福平培养基上出现与原始菌株相同的菌落；其形态特征为菌落圆形、淡黄色，菌体杆状，周毛鞭毛，产芽胞。以BS-2菌株制备植物内生枯草芽孢杆菌制剂。
配方一、花生饼粉培养基(重量％)花生饼粉 1.5-5.0％ 葡萄糖 0.05-2.0％KH2PO40.001-0.2％K2HPO40.001-0.2％CaCO30.001-0.2％ H2O 93-98％配方二、黄豆粉培养基(重量％)黄豆饼粉 1.5-5.0％ 淀粉 0.5-2.0％葡萄糖0.05-2.0％ KH2PO40-0.2％K2HPO40.001-0.2％ CaCO30.001-0.2％H2O 91-97％
配方三、普通细菌NB培养基(重量％)牛肉浸膏 0.1--0.5％ 蛋白胨 0.25--1.0％葡萄糖0.01--0.5％H2O98-99％PH值一般为5.5---8.5，在15℃--50℃条件下，120-250r/min黑暗振荡培养3-120小时，即可获得BS-2植物内生枯草芽孢杆菌制剂。
BS-2菌株的优点可在较低的菌液浓度下主动进入植物体内，并能在植物体内定殖繁殖和传导；对植物同时具有促进生长和防病作用；可在培养36小时左右产生芽孢，菌种容易保存；培养方法简单，易进行工业化生产。
BS-2植物内生枯草芽孢杆菌制剂，具有明显的防病、杀菌和促生作用。大田应用表明，以配方三生产的BS-2植物内生枯草芽孢杆菌制剂，用于浸种时对白菜和辣椒苗鲜重可增加90％以上；喷雾施用时，对辣椒苗和果的炭疽病、白菜炭疽病及香蕉炭疽病具有80％以上的防病效果；以配方一、二生产的BS-2菌制剂的防病效果比用配方三生产的制剂防病效果更好；内生定殖测定表明，BS-2菌株可在辣椒、白菜、黄瓜、甜瓜、番茄、茄子、豇豆、水稻、小麦等多种植物体内定殖传导。本发明的菌种容易保存、培养方法简单、产品可以开发为水剂或粉剂，使用方法简便、易于进行工业化生产，具有良好的开发应用前景。
四、具体实施例为了充分公开本发明的一种植物内生枯草芽孢杆菌及其制剂，下面结合水剂生产的实施例加以说明。
本发明采用由辣椒叶片内分离，经人工诱变筛选出的能在植物体内定殖传导的植物内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis，已于2002年10月14日送交位于北京市中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0819)为生产菌株，产品的配方如下配方一、花生饼粉培养基(重量％)花生饼粉 2.5％ 葡萄糖1.0％KH2PO40.05％ K2HPO40.05％CaCO30.1％ H2O 96.3％配方二、黄豆粉培养基(重量％)黄豆饼粉 2.5％ 淀粉 1.0％葡萄糖1.0％ KH2PO40.1％K2HPO40.1％ CaCO30.1％H2O 95.2％配方三、普通细菌NB培养基(重量％)牛肉浸膏 0.3％蛋白胨 0.5％葡萄糖0.25％ H2O 98.95％调PH值为6.7(灭菌后)，在28℃的条件下，180r/min黑暗振荡培养48小时，即可获得BS-2植物内生枯草芽孢杆菌制剂。
工业生产方法。以植物内生枯草芽孢杆菌BS-2为生产菌种，取上述配方中的一种，进行工业生产。水剂生产工艺按常规工业发酵工艺砂土管菌种→斜面活化→摇瓶考察→种子罐培养→发酵罐培养，将发酵罐培养液加水配兑即可获得BS-2植物内生枯草芽孢杆菌水剂；粉剂生产工艺继上述的发酵罐培养工序之后，按常规粉剂生产工艺过滤浓缩→吸附→喷雾干燥→质量检验→包装→成品入库，即可以生产BS-2植物内生枯草芽孢杆菌粉剂。
权利要求
1.一种植物内生枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌为植物内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.0819；
2.根据权利要求1所述的一种植物内生枯草芽孢杆菌，其特征在于，用抗利福平与拮抗植物病原真菌双标记进行内生测定，从植株体内回收分离的菌株，在含利福平培养基上出现与原始菌株相同菌落；其形态特征为菌落圆形、淡黄色，菌体杆状，周毛鞭毛，产芽胞；
3.一种植物内生枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于以权利要求1或者2所述的植物内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNO.0819为生产菌株，其培养基的配方如下花生饼粉培养基(重量％)花生饼粉 1.5-5.0％ 葡萄糖 0.05-2.0％KH2PO40.001-0.2％K2HPO40.001-0.2％CaCO30.001-0.2％H2O 93-98％
4.根据权利要求3所述的一种植物内生枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于培养基的配方如下花生饼粉培养基(重量％)花生饼粉 2.5％葡萄糖 1.0％KH2PO40.05％K2HPO40.05％CaCO30.1％ H2O 96.3％
全文摘要
一种植物内生枯草芽孢杆菌及其制剂，其菌株BS－2(Bacillussubtilis，CGMCC NO.0819)，是由辣椒叶片内分离，经人工诱变筛选出的新菌株。可在较低的菌液浓度下主动进入植物体内，并能在植物体内定殖繁殖和传导；对植物同时具有促进生长和防病作用；其制剂用于浸种时对白菜和辣椒苗鲜重可增加90％以上；喷雾施用时，对辣椒苗和果的炭疽病、白菜炭疽病及香蕉炭疽病具有80％以上的防病效果。
文档编号A01N63/00GK1506455SQ0214781
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月7日 优先权日2002年12月7日
发明者胡方平, 何红 申请人:福建农林大学