紫茎泽兰链格孢菌代谢物用于生物除草的方法

专利名称：紫茎泽兰链格孢菌代谢物用于生物除草的方法
技术领域：
本发明为紫茎泽兰链格孢菌的代谢产物用于生物除草的方法，属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域，专用于农田、草坪、果园、路埂地杂草的防除。
由于转基因抗除草剂作物的大面积推广使用，传统的选择性强、杀草谱窄、缓效、残留期长的化学除草剂将逐渐被淘汰，而致力于发展杀草迅速、杀草谱广、低毒、低残留、不易导致杂草抗药性的化学除草剂品种，通过培育转基因抗性作物获得大面积推广，这是目前生物除草剂源除草剂研究的主要方向。
以微生物的代谢产物或从微生物中分离得到的植物毒素作为除草剂治理杂草是生物除草剂研究或开发的热点之一，主要集中在土壤中的放线菌和植物病原真菌上。比如由链霉菌产生的双丙氨膦(Bialaphos)、除莠霉素A(Herbimycin A)、杀草菌素(Herbicidin)和茴香霉素(Amismycin)等，链格孢菌产生的AAL毒素、腾毒素(Tentoxin)、交链孢酸(Alternaricacid)和柑桔交链孢菌素(ACRL)等，凹脐蠕孢菌产生的水稻胡麻病菌毒素(Ophiobolins)、色醇(Tryptophol)和Resorcylides等。根据双丙氨膦结构模拟合成的广谱型除草剂草丁膦已经广泛应用于转基因抗草丁膦油菜等作物田。
关于链格孢菌产生的代谢物的除草活性已有些报道，发明人此前已经发现该菌的粗代谢物可以用于控制杂草，并获得了中国发明专利专利号ZL00112560.5。本发明是进一步将粗代谢进行纯化、分离、鉴定出的纯物质。但是，有关利用从粗代谢物中纯化分离出单体毒素控制杂草，仅AAL-toxin毒素的杀草方法申请了专利，在该专利中，曾提及含有该毒素的粗提物的除草活性，其主要有这些特征是主要针对某些阔叶杂草如龙葵、曼佗罗、弗吉尼亚合萌、大果田菁等，对禾本科杂草几乎无效；粗提物是以固体培养基如玉米粉或大米进行固体培养后，经水洗过滤而获得的过滤液，具活性的浓度在1000ppm以上等。因而，没有本发明杀草谱宽，与本发明明显不同。
从链格孢菌固体和液体培养物中分离得到具有除草活性的酰胺类物质细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid)、异细交链孢菌酮酸(结构式)(Iso-tenuazonic acid)，它们互为同分异构体。细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸的物理化学性质参数分子式为C10H15NO3，是一种无色粘滞的油状物；细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸钙和细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸镁、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合钙、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铜等盐为不定形粉末；极易溶于甲醇、乙酸乙酯、二甲亚砜等有机溶剂，在氯仿、苯、冰乙酸、丙酮中溶解不好，在石油醚等低极性的溶剂中溶解性差。
细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid)(左)、异细交链孢菌酮酸(Iso-tenuazonic acid)(右)的结构 细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁 细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合钙不仅在链格孢菌中发现了细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)，且在苹果、胡椒、番茄、小麦、高粱、向日葵种子、胡萝卜、油菜种子、橄榄、柑桔、烟草和水稻等和水稻病原真菌Aspergillus flavus、Pyricularia oryzae、爪哇酒曲霉(Eleusine coracana Gaertn.)等微生物及干木薯、番茄制品等食品中也发现了细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)的存在。细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸的活性已有些报道，细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸能感染水稻植株和烟草形成棕色病斑，能使番茄叶片严重失绿并坏死，还能抑制番茄、水稻、小麦、黑麦和莴苣幼苗的生长；细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸还能抑制胡萝卜种子的萌发和幼苗生长；细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸在10-4M浓度下可以抑制寄生杂草Striga hermonthica种子50％左右的萌发。但关于用细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸茎叶处理，直接杀死生长中的杂草，而不仅仅通过抑制种子萌发的方法防除杂草；杀除的杂草种类也完全不同与报道中的寄生杂草Striga hermonthica，而是涉及到几乎农田发生的所有主要杂草，其防除名录见后，这是没有查到申请了专利或见报道的；特别是细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合钙、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铜、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铁为新化学结构。这些是本专利发明的创新性之所在。
本发明是利用具有植物毒素活性的链格孢菌代谢产物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类作为生物源化学除草剂，用于生物除草。我国目前尚未有一种生物源除草剂产业化，客观上发展生物源除草剂技术，并推动其产业化，将改变我国目前除草剂的产品结构，农药化工的产业结构，全面提升科技含量。该化合物杀草迅速，通常可以在处理之后24小时左右表现明显的受害症状，3-5天杀死杂草。杀草谱(范围)广泛，细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸能安全有效地控制禾本科杂草马唐、稗草、牛筋草、狗尾草、看麦娘、日本看麦娘、菵草、野燕麦、早熟禾、硬草、棒头草、长芒棒头草，阔叶杂草紫茎泽兰、铁苋菜、鳢肠、反枝苋、猪殃殃、大巢菜、鸭舌草、节节菜、水苋菜、马齿苋、播娘蒿、荠菜、鸭跖草、遏蓝菜、小花糖芥、碎米荠、婆婆纳、粘毛卷耳和莎草牛毛毡、异型莎草、碎米莎草、飘拂草发生于农田中的主要杂草。
该发明涉及的化合物活性高，在低至5-70μg/g浓度就具有十分明显的活性，因而是高效生物源化学除草剂。
此外，对环境污染小，残留少，在使用进入土壤后，几乎没有活性，很快钝化。因而，考虑到其是生物源，具有相当高的环境安全性。
本发明链格孢菌的代谢产物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于生物除草的方法，其内容和实施方案如下
细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于控制杂草的方法为将固体或液体培养链格孢菌所得的粗代谢产物经硅胶柱层析和薄层色谱制备纯化得到的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)，在5-500μg/g浓度(或加入少量助剂)之间，可在5天内对杂草和一些作物表现出明显的植物毒性，并能杀死杂草，这些杂草包括了主要的阔叶杂草、禾草和莎草。
根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸盐类为细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸钙、细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸镁、细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸铜、细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸铁、细交链孢菌酮酸、细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸钠、细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸钾、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合钙、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铜、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铁。
根据权利要求1所述的链格孢菌代谢物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于生物除草的方法，其杀草的主要种类为禾本科杂草马唐、稗草、牛筋草、狗尾草、看麦娘、日本看麦娘、菵草、野燕麦、早熟禾、硬草、棒头草、长芒棒头草；阔叶杂草紫茎泽兰、铁苋菜、鳢肠、反枝苋、猪殃殃、大巢菜、鸭舌草、节节菜、水苋菜、马齿苋、播娘蒿、荠菜、鸭跖草、遏蓝菜、小花糖芥、碎米荠、婆婆纳、粘毛卷耳和莎草牛毛毡、异型莎草、碎米莎草、飘拂草等发生于农田中的主要杂草，表明该物质具有广谱性。
根据权利要求1所述的链格孢菌代谢物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于生物除草的方法，其对杂草和作物的植物毒性特征为对杂草幼苗作茎叶处理时，处理12小时后引起杂草明显的受害症状，接触药液处的茎和叶失绿白化、萎蔫、干枯，直至全株死亡。对成长植株，可以引起茎、叶出现褐色病斑，并坏死。在杂草三叶期前进行施药处理为最佳处理期。
根据权利要求1所述的链格孢菌粗代谢物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于生物除草的方法，其助剂的特征为表面活性剂、植物源助剂、增效剂以及渗透剂，主要种类为JFC、SDL、吐温-80、十二烷基磺酸钠、农升GL-110、CGN-3、氮酮、小4204、SDP。
根据权利要求1所述的链格孢菌代谢物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于生物除草的方法，其对杂草的作用机制是细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)使叶片的光合放氧速率和表观量子效率明显降低，作用位点在类囊体膜上，主要抑制光系统II的电子传递活性。
发明人在对紫茎泽兰的生物防治研究过程中发现了野外紫茎泽兰的自然发病现象，故对其寄生真菌进行分离鉴定研究，经过对多各菌株的致病性和产毒特性的筛选研究，获得了链格孢菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)菌株501，对其生物学特性、培养方法、大批量生产工艺、致病性及致病机理进行了深入的研究，发现其致病的主要作用机理是致病植物毒素的产生。通过对链格孢菌经液体培养后滤除活菌后的培养残液，测试培养残液、提取的粗毒素，发现在1-1000μg/ml以内就能使杂草产生明显的毒害症状，引起毒害症状的最快时间在5小时，2天内可以完全杀死杂草。通过对经固体或液体培养链格孢菌株获得的粗代谢产物进行硅胶柱层析分离和薄层色谱制备，分离纯化得到细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)，对该物质进行生物活性测试，发现在5-800μg/g浓度之间，对杂草和一些作物有明显的植物毒性。测试发现用该物质对紫茎泽兰、马唐、无芒稗和鳢肠(对后三者的处理加入少量助剂)作茎叶处理有很好的防除效果；该物质能有效抑制马唐、无芒稗等杂草子实胚根和胚芽的发生，影响其发芽率；对几种作物大豆、水稻、小麦和玉米的子实胚根和胚芽的发生有一定的影响。
将经PDA培养的菌种培养物小块，接种到下列液体培养基之一PSK培养基200g土豆水煮过滤液(四层纱布过滤)，30g蔗糖，1gK2HPO4，加水至1L。
SCSC培养基15g玉米粉+15g黄豆粉，30g蔗糖，3gCaCO3，加水至1L。
或将上述培养基中培养的菌种再转接到固体培养基RHWH中RHWH培养基50g米糠+50g麦麸+33.3ml水液体培养是将接种后的三角瓶在23-26℃温度下，黑暗或12小时光照/12小时黑暗交替，震荡(110转/分钟)培养5-8天，将培养液用滤纸过滤，滤液经大孔树脂吸附，乙醇解吸，减压浓缩，乙酸乙酯萃取浓缩得粗毒素。固体培养是将接种后的不锈钢箩筐在23-26℃温度下，黑暗或12小时光照/12小时黑暗交替，培养8-10天，60℃下烘干后，在培养干物中按培养干物∶水∶乙酸乙酯为2∶1∶10(m/v/v，单位ml或g)的比例加入水和乙酸乙酯，减压(0.1Mpa)蒸馏得馏分，然后常压蒸馏浓缩得粗毒素。细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类的制备是将上述的粗毒素进行多次硅胶柱层析分离，后经TLC多次制备纯化，在酸性条件下得到细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸橙黄色液体，在中性或碱性条件下可以分别得到细交链孢菌酮酸钙、异细交链孢菌酮酸钙、细交链孢菌酮酸镁、异细交链孢菌酮酸镁、细交链孢菌酮酸钠、异细交链孢菌酮酸钠、细交链孢菌酮酸钾、异细交链孢菌酮酸钾、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合钙、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁不定形固体粉末。经分别在细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸液体提取物中加醋酸铜和醋酸铁可以分别获得细交链孢菌酮酸铜、异细交链孢菌酮酸铜、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铜、细交链孢菌酮酸铁、异细交链孢菌酮酸铁、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铁。
用少量甲醇溶解细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)，用蒸馏水分别配制成5-40μg/g浓度的溶液，用紫茎泽兰叶片针刺法做致病性检测，发现随着浓度的升高，细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸对紫茎泽兰叶片的致病性增加，在40μg/g浓度下，48小时后其在紫茎泽兰叶片上形成的病斑为4.9625mm。
在35μg/g的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸钠混合溶液中加入0.1％浓度的助剂，助剂主要有JFC、SDL、吐温-80、十二烷基磺酸钠、农升GL-110、CGN-3、氮酮、小4204、SDP，按平皿离体叶段点滴筛选助剂对该物质药效的发挥的作用，结果发现供试的8种助剂能不同程度地提高细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸对马唐叶片的致病作用，十二烷基磺酸钠的效果最好，它能使细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸在马唐叶片上充分延展开，提高渗透能力，促进药剂在体内的传导，增效作用显著。氮酮和小4204的增效作用也较强。
设计两种配方I.十二烷基磺酸钠+氮酮+小4204+35μg/g的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)溶液；II.十二烷基磺酸钠+氮酮+TFC+35μg/g的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)溶液，利用平皿叶片点滴法将两种配方分别点滴在马唐成熟叶段上，两种配方都大大的提高了药效，分别约为5倍和6倍。
用配方II对温室盆钵种植的三叶期农田杂草，马唐、牛筋草、稗草、鳢肠、铁苋菜、小藜、鸭趾草、水花生、反枝苋、打碗花、苦苣菜等杂草进行茎叶处理，对于某些杂草，处理后12小时即可见对杂草有明显伤害作用，杂草叶片萎蔫，2-3天后叶片失绿白化，直至干枯死亡。
用5-70μg/g的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)溶液处理马唐、无芒稗、硬草、鳢肠、大巢菜、小麦、玉米、大豆、水稻的子实，对马唐、无芒稗、水稻和小麦的子实发芽率；马唐、无芒稗、水稻和玉米子实胚根的伸长；水稻和小麦子实胚芽的伸长有显著的抑制作用。
细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)对杂草的作用机制是它能影响植物的光合作用，使叶片的光合放氧速率和表观量子效率明显降低，其作用位点在类囊体膜上，主要抑制两个光系统的电子传递活性，但并不影响类囊体中膜蛋白的合成和降解，尤其是对于光合系统II中的角蛋白。
本发明的主要优点和积极效果如下1)链格孢菌粗代谢产物用于生物除草，已经获得专利，但是，先前的专利中没有涉及到有效成分的具体物质结构，不利于在应用过程中有效控制其活性成分的含量和产品质量，本发明是在先前专利基础上进一步深入研究，获得的进展，分离、纯化、鉴定出活性物质的结构，可以经浓缩、纯化，提高产品的有效性和杀草效果，显著降低了用量。
2)细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸的物质结构简单，易于人工模拟合成，由于本发明明确了对农田杂草具有广谱杀草活性，可以为化学合成结构类似的化学除草剂提供模板。细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合钙、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铜、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铁是首次报道的新化合物，其具有的生物学活性对研究化合物的生理活性机制，对化学合成除草剂有积极的参考价值。
已经报道的具有除草活性的链格孢菌毒素如腾毒素(Tentoxin)、交链孢酸(Alternaricacid)和柑桔交链孢菌素(ACRL)的结构复杂，人工模拟合成相对困难，且成本较高。
3)已经报道细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸对水稻、番茄、小麦、黑麦、莴苣、烟草等作物的叶导致褐色病斑，抑制其幼苗的生长，此外，报道对寄生杂草独角金的种子萌发有抑制活性，但是，没有见对农田主要杂草具有杀灭作用，本发明发现了细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸特别是其盐类具有广谱杀除农田杂草的活性，在最低5μg/g的低浓度下就能对紫茎泽兰、马唐等杂草造成毒害作用，作用迅速，用量低，对环境污染小，因而是高效生物源化学除草剂，这发展了对这类物质在生物除草上的利用价值和应用前景。由于该物质的作用迅速，可以作为百草枯和草甘膦两种大量应用灭生性除草剂的替代品。百草枯的环境毒性较高属中毒，而草甘膦的作用缓慢，杀灭杂草的最快速度也在10天以上。
现有技术中链格孢菌代谢物AAL-Toxin用于除草，主要针对某些阔叶杂草如龙葵、曼佗罗、弗吉尼亚合萌、大果田菁等，对禾本科杂草几乎无效；本发明可以用于控制发生于农田主要的杂草包括马唐、稗草、牛筋草、狗尾草、看麦娘、日本看麦娘、菵草、野燕麦、早熟禾、硬草、棒头草、长芒棒头草，阔叶杂草紫茎泽兰、铁苋菜、鳢肠、反枝苋、猪殃殃、大巢菜、鸭舌草、节节菜、水苋菜、马齿苋、播娘蒿、荠菜、鸭跖草、遏蓝菜、小花糖芥、碎米荠、婆婆纳、粘毛卷耳和莎草牛毛毡、异型莎草、碎米莎草、飘拂草。
4)以细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)做茎叶处理可以防除绝大多数的农田主要杂草，使用方便，可以见草杀草。此外，对环境污染小，残留少，在使用进入土壤后，很快钝化，因而，考虑到其是生物源，具有相当高的环境安全性。
实施例实施例1将紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)自然致病菌——链格孢菌(Alternariaalternata(Fr.)Keissler)的21株自然变异菌株在PDA培养基上，25℃黑暗培养三天后置于15W紫外灯下30cm处，12小时照射/12小时黑暗交替培养7天，用无菌水冲洗得孢子溶液，接种105个孢子于80mlPSK培养基中，25℃，100r/min培养6天，培养液滤纸过滤后，在121℃下，灭菌20分钟得到无菌滤液。取紫茎泽兰第三片叶子，先用自来水冲洗干净，再用0.1％HgCl2处理35min，无菌水清洗3次，用灭菌的滤纸吸干叶表面水分；在叶背面离叶缘1-2cm处针刺造成轻微伤害，分别吸取无菌滤液20μl滴于针刺处，在25±1℃下，光照时间12h后，测量病斑直径，置于解剖镜下，测定病斑的直径大小，最后统计分析，确定菌株的产毒能力差异，结果见表2。
表2表明菌株NEW、新402、新501和安501四个菌株的致病力均显著高于其它菌株，其中NEW菌株的致病力最强，其中的致病毒素应该是最高的，可作为产毒菌株培养用于毒素生产。
表2 21个菌株PSK培养滤液致病力比较菌株病斑直径(mm)5％差异水平 1％差异水平NEW 5.138 aA新4024.963 aAB新5014.669 bB501 4.6235bBA婆 2.5865cCB2.401 cd CD原5032.3135dCDE501-12.212 de DE402 2.1525de DE501-42.002 ef EF501-J1.785 fF501-51.764 fF马A 1.141 gGqs-503 1.092 gGQZ-101 1.015 gGAW 0.91 gGLS 0.5775hHI501-30.5565hHI501-20.4165hi HIYN 0.3745hi HICK 0.1855iI实施例2将501菌株接种在SCSC液体培养基中，于温度为25±1℃、光照为12h/d、摇速为110rpm/min的条件下培养5-7天。将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0.45μm微孔薄膜过滤，得无菌滤液。100-200目的层析用硅胶柱层析，按极性由弱到强的顺序用不同的溶剂系统不连续梯度洗脱。
洗脱溶剂系统的加入顺序为石油醚→石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1→石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1→石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1→石油醚∶乙酸乙酯＝1∶3→石油醚∶乙酸乙酯＝1∶5→乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1→乙酸乙酯∶甲醇＝3∶1→乙酸乙酯∶甲醇＝1∶1→乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3→乙酸乙酯∶甲醇＝1∶5→甲醇。
(2)第2次硅胶柱层析(方法同上)将1次硅胶柱层析石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1和石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1洗脱下来的有生物活性的部位分别再次上100-200目硅胶柱，溶剂系统进一步细化，先后为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1→石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1→石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2→石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1→乙酸乙酯→乙醇，常压浓缩后用水稀释一定的倍数检测生物活性，有活性部位依预知检测硅胶板上的展开情况合并，备TLC制备分离。
将柱层析得到的有活性部位物质用适量乙酸乙酯溶解，用点样用毛细管点条斑于TLC制备板的基部，用展开剂展开后，分别刮下装柱，用乙酸乙酯或乙醇冲洗至无物质流出为止，改变层析条件，跟踪活性物质，反复制备，在酸性条件下常压浓缩得到橙黄色液体，在中性或碱性条件下常压浓缩得到无定形橙色固体粉末。
实施例3用少量甲醇溶解细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸混合物后，用蒸馏水分别配制5μg/g、10μg/g、15μg/、20μg/g、25μg/g、30μg/g、35μg/g、40μg/g浓度的溶液，同时设相当浓度的甲醇溶剂对照和清水对照，用紫茎泽兰叶片针刺法做致病性检测，每处理重复6次以上，25℃，自然光照下保湿放置48h后用显微测微尺测量病斑直径。
表3表明细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸混合物对紫茎泽兰有较高的致病性，在5μg/g的浓度条件下就可见明显的植物毒性，与无菌滤液的毒性相当，但与对照相比差异极显著(P＜0.01)。
表3不同浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸对紫茎泽兰的致病性检测的方差分析结果处理平均值(mm)5％差异1％差异清水CK 0.27675 hH溶剂CK 0.288hH无菌滤液 0.7065 gG5μg/g 0.798gFG10μg/g0.972fF15μg/g1.197eE20μg/g1.31 de DE25μg/g1.434dD30μg/g4.316667 cC35μg/g4.688889 bB40μg/g4.9625 aA实施例3用少量甲醇溶解细交链孢菌酮酸镁、异细交链孢菌酮酸镁和细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根镁后，加蒸馏水分别配制50μg/g浓度的溶液，同时设相当浓度的甲醇溶剂对照和清水对照，用紫茎泽兰叶片针刺法做致病性检测，每处理重复6次以上，25℃，自然光照下保湿放置48h后用显微测微尺测量病斑直径。
表3表明细交链孢菌酮酸镁、异细交链孢菌酮酸镁和细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁对紫茎泽兰均有较高的致病性，在50μg/g的浓度条件下就可见明显的植物毒性，明显高于无菌滤液的毒性，相比差异极显著(P＜0.01)。
表3不同浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸对紫茎泽兰的致病性检测的方差分析结果处理平均值(mm) 5％差异 1％差异清水CK 0.27675bB溶剂CK 0.288 bB无菌滤液0.7065 bB细交链孢菌酮酸镁2.78 aA异细交链孢菌酮酸镁 2.972 aA细交链孢菌酮酸根·异3.197 aA细交链孢菌酮酸根二合镁实施例4分别用0.1％浓度的TFC、SDL、吐温-80、十二烷基苯磺酸钠、农升GL-110、CGN-3、氮酮、小4204和35μg/g浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)混合物溶液混合，按平皿离体叶段点滴筛选助剂的方法比较8种供试助剂的增效作用差异。同时设清水对照CK0、0.1％浓度的助剂对照CK1和35μg/g浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)溶液对照CK2，每处理重复6次。对结果进行分析，分析结果见表4，表4结果表明供试的8种助剂能不同程度地提高粗毒素对马唐叶片的致病作用，其中助剂十二烷基苯磺酸钠效果是最好的，它能使粗毒素在马唐叶片上充分延展开，提高渗透能力，促进药剂在体内的传导，增效作用明显。助剂G(氮酮)和H(小4204)的增效作用也较强。
表4不同助剂的增效作用差异0.1％浓度 JFCSDL吐温-80十二烷基 农升 CGN-3 氮酮 小4204苯磺酸钠 GL-110CK0(mm)0 0 0 0 0 0 0 0CK1(mm)0 0 0 0 0 0 0 0CK2(mm)3.882353 3.882353 3.882353 3.882353 3.882353 3.882353 3.882353 3.882353处理(mm) 4.64.7 5.655556 12.8757.9 4.485714 11.0714311.6实施例5利用平皿叶片点滴法将设计好的两种配方分别点滴于马唐成熟叶段上，设清水对照CK0、助剂对照CK1和35μg/g浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)混合物溶液对照CK2。每处理重复16次。配方中各种助剂的浓度皆为0.1％。处理结果见表3。
配方I助剂D+助剂G+助剂H+35μg/g浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)混合物溶液；配方II助剂D+助剂G+助剂A+35μg/g浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)混合物溶液对结果进行方差分析，结果见表5。从表5中分析的结果我们可发现配方I提高了细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸(盐)混合物药效的5倍左右，但不如配方II，配方II的增效作用更加明显，提高药效在6倍以上，配方II的增效作用极显著(P＜0.01)高于配方I。
表5两种配方对马唐离体叶片毒性的方差分析处理平均病斑直径(单位mm)5％差异1％差异CK0 0d DCK1 I 0d DCK1 II 0d DCK2 3.88 c C配方I 18.28b B配方II 30.26a A实施例6用实施例4中配方II对温室盆钵种植的三叶期杂草幼苗进行茎叶处理。用药量以杂草茎叶表面湿润为度，每处理重复3次，同时设清水CK1和助剂CK2，2d后统计发病情况。病害情况的统计标准见表6。统计结果见表7。
从表7中可以看出用配II可以防除农田主要的禾本科杂草、莎草、阔叶草马唐、牛筋草、稗草、鳢肠、铁苋菜、小藜、鸭趾草、水花生、反枝苋、打碗花、苦苣菜等，施药期宜在幼苗三叶期前。
表6评价配方引起杂草茎叶病害严重程度的标准病害级别伤害程度4植株完全死亡3植株茎叶2/3干枯2植株茎叶1/2干枯1植株茎叶1/3干枯0植株完好，无任何伤害表7配方II对杂草作茎叶处理的结果科名植物种类 CK1 CK2配方II禾本科 牛筋草002狗尾草003马唐 004稗草 003薏苡 002苋科反枝苋002水花生004
刺苋001锦葵科木槿002苘麻001蓼科 酸模叶蓼003羊蹄000扛板归 003水蓼003齿果酸模002大戟科铁苋菜 002马鞭草科 牡荆001大麻科葎草001唇形科白苏001一串红 000宝盖草 001荠苧001玄参科婆婆纳 001波斯婆婆纳 000鸭跖草科 鸭跖草 004火柴头 004旋花科打碗花 004马蹄筋 001牵牛002菊科 万寿菊 001苍耳002小飞蓬 002鳢肠003苦苣菜 003马兰004黄鹌菜 001续断菊 001白日菊 001一年蓬 003美洲豚草001天明精 000紫茎泽兰004豆科 三叶草 001蔷薇科蛇莓001葡萄科乌敛莓 002爬山虎 002藜科 小藜002酢浆草科 酢浆草 004车前科车前000莎草科莎草003异型莎草004水虱草 003实施例7少量甲醇溶解不同的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸盐后，用蒸馏水分别配制5μg/ml、50μg/ml和500μg/ml的三个浓度的溶液，对温室盆钵种植的三叶期马唐和鳢肠幼苗进行喷雾法茎叶处理。用药量以杂草茎叶表面湿润为度，每处理重复3次，同时设清水CK，2d后统计发病情况，病害情况的统计标准见表6，统计结果见表8。
表8不同的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸盐对杂草作茎叶处理的结果盐类 杂草CK 5μg/ml 50μg/ml 500μg/ml细交链孢菌酮酸钙 马唐0 1 4 4鳢肠0 1 3 4细交链孢菌酮酸镁 马唐0 1 4 4鳢肠0 1 3 4细交链孢菌酮酸铜 马唐0 1 4 4鳢肠0 0 2 4细交链孢菌酮酸铁 马唐0 1 4 4鳢肠0 0 2 4细交链孢菌酮酸钠 马唐0 1 4 4鳢肠0 1 3 4细交链孢菌酮酸钾 马唐0 1 4 4鳢肠0 1 3 4异细交链孢菌酮酸 马唐0 1 3 4钙 鳢肠0 1 3 4异细交链孢菌酮酸 马唐0 1 3 4镁 鳢肠0 1 2 4异细交链孢菌酮酸 马唐0 1 2 4铜 鳢肠0 0 3 4异细交链孢菌酮酸 马唐0 1 3 4铁 鳢肠0 0 2 4异细交链孢菌酮酸 马唐0 1 4 4钠 鳢肠0 1 4 4异细交链孢菌酮酸 马唐0 1 3 4钾 鳢肠0 1 4 4细交链孢菌酮酸 马唐0 1 3 4根·异细交链孢菌酮鳢肠0 1 3 4酸根二合钙细交链孢菌酮酸 马唐0 1 3 4根·异细交链孢菌酮鳢肠0 1 3 4酸根二合镁细交链孢菌酮酸 马唐0 1 2 4根·异细交链孢菌酮鳢肠0 1 3 4酸根二合铜细交链孢菌酮酸 马唐0 1 2 3根·异细交链孢菌酮鳢肠0 1 2 3酸根二合铁从表8中可以看出，细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸盐在50μg/ml至500μg/ml间可以有效地防除具有代表性的禾草马唐和阔叶杂草，并建议施药期宜在幼苗三叶期前。
实施例8少量甲醇溶解细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸混合物后，用蒸馏水分别配制5μg/ml、8.75μg/ml、17.5μg/ml、35μg/ml、70μg/ml浓度的溶液，作马唐、无芒稗、硬草、鳢肠、大巢菜、小麦、玉米、大豆、水稻子实的发芽抑制作用试验。子实先用自来水冲洗净后，再用0.1％HgCl2处理3-5min，无菌水清洗干净后用灭过菌的吸水纸吸干表面水分。每处理重复3次，每次重复除小麦、玉米、大豆和水稻用子实30粒外，其它植物子实用100粒，同时设清水对照CK。试验在直径9cm培养皿中进行，每个培养皿中药液或对照物质的用量为5ml，置于25℃光照培养箱中，保持光照12h/d，小麦、玉米、大豆和水稻5d后，其它植物10d后计算发芽率(以胚根与子实等长为发芽)，分别测量芽长和根长，结果见表9。
表9不同浓度的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸混合物对杂草和作物子实萌发的影响CK 5μg/g 8.75μg/g 17.5μg/g 35μg/g 70μg/g发芽率％ 733618 9 0 0马唐胚根长度cm4.01 1.08 0.400 0 0胚芽长度cm1.28 0.75 0.950.810.230发芽率％ 807347 22 14 17无芒稗 胚根长度cm2.91 0.52 0.060 0 0胚芽长度cm4.16 4.12 3.122.462.181.89发芽率％ 929292 85 65 7硬草胚根长度cm5.95 6.88 5.352.570 0胚芽长度cm6.50 7.53 7.586.552.240.60发芽率％ 808487 78 34 0鳢肠胚根长度cm0.82 0.92 0.920.320.060胚芽长度cm0.99 1.03 1.040.550.220发芽率％ 817353 33 10 0大巢菜 胚根长度cm0.52 0.42 0.460.390.130胚芽长度cm1.65 1.21 1.220.420.040发芽率％ 100 100 98 89 59 0小麦胚根长度cm4.68 5.01 2.541.470.080胚芽长度cm3.81 4.58 2.562.000.600发芽率％ 989875 78 78 75玉米胚根长度cm8.28 6.44 4.761.520.840.35胚芽长度cm2.71 3.42 2.722.261.661.82发芽率％ 7595100 90 95 75
大豆 胚根长度cm5.513.13 4.485.663.04 0胚芽长度cm4.383.65 4.302.473.79 3.72发芽率％ 90 60 52 0 0 0水稻 胚根长度cm2.020.60 0.590 0 0胚芽长度cm1.151.02 0.670 0 0表9结果显示，在特定浓度下，细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸混合物对马唐、无芒稗等杂草，对水稻、小麦等作物子实的萌发具有抑制作用，而对大豆子实萌发的影响较小，这可以作为细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸作为生物除草剂除草的施用范围的依据。
权利要求
1.细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于控制杂草的方法为将固体或液体培养链格孢菌所得的粗代谢产物经柱层析和薄层色谱制备纯化得到的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类，在5-800μg/g浓度，茎叶喷雾杂草，可在5天内使杂草表现出明显的毒害症状，并杀死杂草，添加合适的助剂增加其杀草活性。
2.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸盐类为细交链孢菌酮酸钙、异细交链孢菌酮酸钙、细交链孢菌酮酸镁、异细交链孢菌酮酸镁、细交链孢菌酮酸铜、异细交链孢菌酮酸铜、细交链孢菌酮酸铁、异细交链孢菌酮酸铁、细交链孢菌酮酸钠、异细交链孢菌酮酸钠、细交链孢菌酮酸钾、异细交链孢菌酮酸钾，以及新化合物细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合钙、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合镁、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铜、细交链孢菌酮酸根·异细交链孢菌酮酸根二合铁。
3.根据权利要求1所述的链格孢菌代谢物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于生物除草的方法，其杀草的主要种类为主要的阔叶杂草、禾草和莎草，表明该物质具有广谱性。
4.根据权利要求1所述的链格孢菌粗代谢物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其盐类用于生物除草的方法，添加合适的助剂增加其杀草活性，其助剂的特征为十二烷基磺酸钠、农升GL-110、氮酮、小4204。
全文摘要
本发明为紫茎泽兰链格孢菌的代谢产物细交链孢菌酮酸、异细交链孢菌酮酸及其主要盐类用于控制杂草的方法，属于微生物应用于农业植物保护领域；用5－800μg/g浓度茎叶喷雾处理农田的主要阔叶草、禾草和莎草，迅速导致杂草受害，直至萎蔫，干枯死亡，具有广谱、快速、高效的杀草活性；加合适的助剂增加了杀草活性。
文档编号A01M21/00GK1644046SQ20051003826
公开日2005年7月27日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者强胜, 董云发, 安传福, 周兵, 朱云枝, 陈世国, 戴新宾, 戴宝江, 蔡建国 申请人:南京农业大学, 南通江山农药化工股份有限公司