专利名称：Il-8受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基) 脲对曱苯磺酸盐，包含该化合物的药物组合物，及其在治疗IL-8、 GROi 、 GRO[]、 GRO口、 NAP-2和ENA-78介导的疾病中的用途。
背景技术：
白介素-8 (Interleukin-8， IL-8)具有很多不同的名称，如嗜中性粒细胞吸 引/活化蛋白-1 (NAP-1)、单核细胞衍生的嗜中性粒细胞趋化因子(MDNCF)、 嗜中性粒细胞活化因子(NAF)和T-细胞淋巴细胞趋化因子。白介素-8为嗜中 性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T-细胞亚型的化学引诱物(chemoattractant)。其由 许多有核细胞生成，该核细胞包括暴露于TNF、 IL-la、 IL-ip或LPS的巨噬 细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞，以及当暴露于LPS或趋化因子如 FMLP由嗜中性粒细胞本身生成。
GROa、 GROP、 GROy和NAP-2也属于趋化因子a家族。象IL-8—样，这 些趋化因子也有着不同的名称。例如GROa、 p、 Y分别称为MGSAa、卩和y (黑 素瘤生长刺激活性)。所有这些a-家族的趋化因子与IL-8 B受体(CXCR2)结 合，这些趋化因子具有直接在CXC基序前的ELR基序。
IL-8、 GROa、 GROp、 GROy、 NAP-2和ENA-78在体外刺激很多功能。 它们都显示出具有对嗜中性粒细胞的化学引诱物特性，而IL-8和GROa已 显示具有T-淋巴细胞和嗜碱性粒细胞趋化的活性。此外，IL-8可从正常和特 应性个体的嗜碱性粒细胞中诱导组胺释放。此外，GRO-a和IL-8可从嗜中 性粒细胞中诱导溶菌(lysozomal)酶释放和呼吸爆发(respimtory burst)。也已显 示IL-8增加Mac-l (CDllb/CD18)在嗜中性粒细胞上的表面表达而没有从头 合成蛋白。这可有助于嗜中性粒细胞与血管内皮细胞的粘合力增加。许多已 知的疾病的特征为大量嗜中性粒细胞浸润。由于IL-8、 GROa、 GRO(3、 GROy 和NAP-2促进嗜中性粒细胞的聚积和活化，因此这些趋化因子涉及于广泛 的急性和慢性炎性疾病，包括牛皮癣和类风湿性关节炎。此外，ELR趋化因子(那些含氨基酸ELR基序恰好在CXC基序前的趋化因子)还在血管4丐化中涉及。
在体外，IL-8、 GROa、 GRO|3、 GROy和NAP-2通过结合至并活化七跨 膜G蛋白偶联家族的受体，尤其是通过结合至IL-8受体，特别是IL-8(3受体 (CXCR2)而诱导嗜中性粒细胞形状改变、趋化作用、颗粒释放和呼吸爆发。 已经开发了对于该受体家族成员的非肽小分子拮抗剂。因此，该IL-8受体代 表一种开发新的抗炎药的有希望的靶点。
在该领域仍然需要能与CXCR1和/或CXCR2受体结合的用于治疗的化 合物。因此，与IL-8生成增力口(其为嗜中性粒细胞和T-细胞亚型进入炎性位 点的趋化性的原因)相关的病症将受益于IL-8受体结合抑制剂的化合物。这 些化合物公开于WO 2004/039775，美国专利6,180,675和美国专利6,500,863 中。
发明概述
本发明涉及N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基) 脲对甲苯磺酸盐(本发明化合物)，和包含本发明化合物以及可药用载体或稀 释剂的组合物。
本发明也涉及包含本发明化合物和一种或多种其它治疗成分的组合。 本发明还涉及一种治疗趋化因子介导的疾病的方法，其中所述趋化因子 为与IL-8n或n受体结合的趋化因子，且该方法包括给药有效量的本发明化合物。
本发明也涉及一种在有此需要的哺乳动物中，尤其在人中，抑制IL-8 与其受体结合的方法，该方法包括给药有效量的本发明化合物。
发明详述
本发明涉及N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基) 脲对曱苯磺酸盐，和包含本发明化合物以及可药用载体或稀释剂的组合物。 本发明也涉及包含本发明化合物和一种或多种其它治疗成分的组合。 本发明还涉及一种治疗趋化因子介导的疾病的方法，其中所述趋化因子 为与IL-8[]或r」受体结合的趋化因子，且该方法包括给药有效量的本发明化合 物。
5本发明也涉及一种在有此需要的哺乳动物中，尤其在人中，抑制IL-8
与其受体结合的方法，其包括给药有效量的本发明化合物。
本发明还涉及一种治疗译喘、慢性阻塞性肺病和成人呼吸系疾病的方 法。尤其是，本发明涉及使用本发明化合物治疗阻塞性肺病的方法。
制备方法
N-「4-氯-2-羟基-3-(哌嗪-l-磺酰基)苯基l-N'-(2-氯-3-氟苯基)脲对曱苯磺
<formula>formula see original document page 6</formula>化合物1的制备
将3，4-二氯苯胺(100 g)溶于四丁基曱基胺(TBME) (660 mL)中，并冷却 至10-15 。C。加入氢氧化钠(94 g, 30%水溶液)，并通过机械搅拌器剧烈搅 拌该溶液。以保持内部温度低于35。C的速度加入三曱基乙酰氯(84mL)。当 加入完成(10-15分钟)时，将混合物在30-35 。C保持约30分钟，然后经30-40 分钟冷却至0-5。C。将反应混合物在0-5 。C保持1小时，然后过滤，首先用 90:10水/曱醇(400 mL)洗涤，然后用水(600 mL)洗涤。于50-55 。C真空下干 燥，得到产物，为灰白色结晶。产量为127g。
化合物2的制备
在惰性气体氮气下，将化合物1 (300mL)的溶液冷却至-50--40 °C。以 保持溶液内部温度为-45 --30 。C的速度加入正丁基锂(2.5M的己烷溶液，179 mL)(约加入15-30分钟)。将该溶液保持在约-35 - -25 。C，直到HPLC显示 初始反应完全。然后将溶液再冷却至-45 - -40 。C，并向溶液中鼓入二氧化石克 ( 16.9 g)，保持内部温度低于约-14 。C，直到溶液为酸性。当反应完全后， 将混合物温热至-10-0。C。然后在-2-3。C下开始，经5-15分钟将磺酰氯 (25.2 mL)滴加至该四氢呋喃溶液中，保持温度低于约22 。C。 5分钟后，HPLC 证实反应完全，同时将溶液保持在约10-15 。C。在减压下将混合物溶剂交 换为a,a,a-三氟曱苯，过滤，真空下部分浓缩(至 100 mL),然后加入二氯曱 烷(350 mL)。在环境温度下向该混合物中滴加哌。秦(61.2 g)的二氯曱烷(625 mL)溶液，保持溶液的内部温度为15-27。C(用2小时加入)。将反应保持在 20 - 24 。C直到反应完全。混合物用去离子水(200 mL)洗涤，浓缩有机层， 然后加入庚烷(450 mL)。产物(70.5 g)通过过滤分离，用庚烷(50-100 mL)洗涤, 于50-55 。C真空下干燥。<formula>formula see original document page 7</formula>化合物3的制备
将化合物2 (!30 g)加入到 16。/。 (w/w，于水中)的硫酸(300 mL)中。将所 得混合物在99-103°C下加热至回流，持续 6小时。反应完成后，将溶液冷 却至40-50 。C，然后在减压下浓缩至-60 mL。加入乙腈(225 mL)，并在20-25°C 下将所得的混悬液搅拌 1小时。产物通过过滤分离，用乙腈(135 mL)洗涤， 且于45-50 。C真空下干燥。产量为33.34 g。
化合物4的制备
将化合物3 (20 g)加入至去离子水(200 mL)中。通过加入50%氬氧化钠 水溶液( 6.35 mL)将所得溶液的pH调节至6.5 - 7.0,同时保持内部温度为 20 - 30 。C。然后加入焦碳酸二叔丁酯(8.9 g)的乙酸乙酯(80 mL + 20 mL淋洗) 溶液。通过加入50%氢氧化钠水溶液(2.45 mL)将所得混合物的pH调节至6.8 -7.0，同时保持内部温度为20 - 30 °C。反应完成后，过滤反应溶液以除去 少量的沉淀。分离滤液的两层，水层用乙酸乙酯(140mL)萃取。合并的乙酸 乙酯层用水(40 mL)洗涤，并浓缩至100mL。加入庚烷(IOO mL),并将所得 混悬液浓缩至60mL。重复该步骤一次。然后加入庚烷(140 mL)，并将所得 混悬液在20 - 25 。C下搅拌~1小时。产物通过过滤分离，用庚烷(80 mL)洗涤， 并于40-45 T真空下干燥。产量为15.3 g。
化合物5的制备
将化合物4 (10 g)加入至二曱基甲酰胺(20 mL)和乙腈(80 mL)中。加入 2-氯-3-氟苯基异氰酸酯(4.77 g)，同时保持内部温度为20 - 30 。C,然后用 10mL乙腈淋洗。所得混合物在20-25 °C下搅拌~2小时。反应完成后，加入 曱醇(50 mL)。将所得混悬液在20-25 。C下搅拌 10分钟。加入去离子水 (150mL)，并将所得混悬液在20-25 。C下搅拌~1小时。产物通过过滤分离， 用去离子水(100mL)和曱醇(15-20 mL)洗涤，然后于40~45 。C真空下干燥。 产量为14.15g。
化合物6的制备-方法1
将化合物5 (50 g)溶于四氢呋喃(THF， 200 mL)中，并加热至33-37 。C,且保持在33-37 。C。在另一个反应器中，制备乙腈(250 mL), THF (50 mL) 和对曱苯磺酸一水合物(43.9g)的溶液。将所得溶液加热至33-37 。C，并保持 在33-37 。C。过滤对曱苯磺酸溶液，并转移至含化合物5和THF的反应器中， 同时保持温度为33-37 °C。当起始原料消耗完后，将微粉化的产物晶种(0.5g) 加入到最小量的乙腈(5 mL)中。然后经~40分钟将反应混合物加热至 53-57°C,并在此温度保持至少4小时。将反应冷却至0-5。C，产物通过过滤 分离，用乙腈(250mL)洗涤，且于55-60。C真空下干燥。产量为52.24g。
化合物6的制备-方法2
将化合物5 (500 g)加入到反应器1中，然后加入乙腈(CAN, 3750 mL) 和四氢呋喃(THF， 1250 mL)。然后将溶液加热至60-65 。C，且当观察到澄清 溶液时，进行澄清过滤到反应器2中。向反应器l中，加入对甲苯磺酸一水 合物(TsOH.H20， 439 g)，然后加入ACN (750 mL)和THF (250 mL)。将混合 物加热至40-45 。C，且当观察到澄清溶液时，进行澄清过滤，将该溶液加入 到反应器2 (含有起始原料溶液)中，且保持反应器2中的温度为50-60 。C。 将混合物加热至回流，并保持在70-80 。C直到反应完全。通过常压蒸馏移除 ~3500 mL的溶剂。然后在反应器中加入2.5 L水，然后加入4 L ACN，并调 节温度至70-80 。C。观察到溶解后，将所得溶液冷却至64-68 。C。 5-10分钟 后，将粉碎的产物晶种(5g)加入到最小量的乙腈中，并在64-68 。C下保持1 小时。经2小时将混合物冷却至0-5。C，并在0-5。C下保持 30分钟，然后 通过过滤分离产物。固体产物用2.5L乙腈洗涤，并于50-60 。C真空下干燥。 产量为480 g。
治疗方法
性治疗任何疾病状态的药物，该疾病由哺乳动物细胞(例如，但不限于，单 核细胞和/或巨噬细胞)生成的过度的或未调节的IL-8细胞因子或结合至 IL-8a或卩受体的其它趋化因子(也称为I型或II型受体)恶化或引起的。
因此，本发明提供一种治疗趋化因子介导的疾病的方法，其中该趋化因 子是结合至IL-8 a或p受体的趋化因子，且该方法包括给药有效量的本发明 化合物。具体地，该趋化因子为IL-8 、 GROa、 GRO卩、GROy、 NAP-2或ENA-78 。将本发明化合物以足以抑制细胞因子(特别是IL-8、 GROa、 GRO卩、 GROy、 NAP-2或ENA-78)功能的量给药，以使它们被生物调节降至生理功 能的正常水平，或在一些情况下降至低于正常水平，从而来改善疾病状态。 异常水平的IL-8、 GROa、 GRO|3、 GROy、 NAP-2或ENA-78，例如，在本 发明中，由以下几种情况组成(i)游离IL-8水平大于或等于l皮克/mL; (ii) 任何细胞相关的IL-8、 GROa、 GRO|3、 GROy、 NAP-2或ENA-78高于正常 生理水平；或(iii)在细胞或组织中存在IL-8、 GROa、 GROp、 GROy、 NAP-2 或ENA-78高于基础水平，其中IL-8、GROa、GRO卩、GRQy、NAP-2或ENA-78 分别生成。
存在许多疾病状态，其中在恶化和/或造成该疾病中涉及过度的或未调 节的IL-8产生。趋化因子介导的疾病包括牛皮癣、特应性皮炎、骨关节炎、 类风湿性关节炎、哞喘、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综合征、炎性肠病、 节段性回肠炎(Crohn，sdisease)、溃痴性结肠炎、中风、败血症性休克、内毒 素性休克、革兰氏阴性脓毒症(gram negative sepsis)、中毒性休克综合症、心 '脏禾口肾再灌注损伤(cardiac and renal reperfusion injury)、肾小J求肾炎、血栓开j 成、移植物抗宿主反应(graft vs. host reaction),阿尔茨海默氏病、同种异体 移植排斥、疟疾、再狭窄(restinosis)、血管生成、动脉粥样硬化、骨质疏松、 龈炎、病毒病(viral disease)例如鼻病毒或不希望的造血干细胞释放。
尤其是，本发明的化合物用于治疗哞喘、慢性阻塞性肺病和成人呼吸窘 迫综合征。优选地，本发明化合物用于治疗慢性阻塞性肺病。
本发明的疾病的主要特征在于大量嗜中性粒细胞浸润(massive neutrophil infiltration)、 T画细胞浸润或新生血管生长(neovascular growth),且 其与增加的IL-8、 GROa、 GROP、 GROy、 NAP-2或ENA-78产生相关，该 增加的IL-8、 GROa、 GROp、 GROy、 NAP-2或ENA-78产生是造成嗜中性 粒细胞进入炎性位点的趋化性或内皮细胞的定向生长的原因。与其它炎性 细月包因子(IL-1、 TNF和IL-6)不同，IL-8、 GROa、 GRO卩、GROy、 NAP-2 或ENA-78具有促进嗜中性粒细胞趋化性、酶释放(包括但不限于弹性蛋白酶 释放)以及过氧化物产生和活化的独特性质。该a-趋化因子，尤其是GROa、 GRO(3、 GROy、 NAP-2或ENA-78，通过IL-8 I型或II型受体发挥功效，可 通过促进内皮细胞的定向生长促进胂瘤的新血管形成。因此，抑制IL-8诱导 的趋化性或活化将导致嗜中性粒细胞浸润的直接减少。最近的证据也表明趋化因子在治疗HIV感染中的作用，Littleman等人, Nature 381, pp. 661 (1996)和Koup等人，Nature 381, pp. 667 (1996)。
目前的证据也表明使用IL-8抑制剂可治疗动脉粥样硬化。第一份文献， Boisvert等人，J. Clin. Invest, 1998, 101:353-363表明，通过骨髓移植，IL-8受 体在干细胞(并且因此在单核细胞/巨噬细胞)的缺失导致在LDL受体缺失小 鼠中粥样硬化斑块发展的减少。
本发明还提供治疗CNS损伤的方法。这种治疗在紧急治疗(acute setting) 中使用，也用来在那些认为易于损伤的个体中预防损伤。
在此定义的CNS损伤包括开放性或穿通性头部创伤，例如通过手术， 或闭合性颅脑损伤，例如通过对头部区域的损伤。同样在此定义内的为缺血 性发作(ischemic stroke),特别是对于脑区域。
缺血性发作可定义为局部神经疾病，其由对特定脑区域的不充足的血液 供给所致，通常为栓子、血栓症或血管的局部粥样闭合的结果。炎性细胞因 子在该区域的作用已经显现出来，而本发明提供有效治疗这些损伤的方法。 对于例如在此所述的急性损伤的相对较小的治疗已经可以得到。
TNF-a是具有促炎作用的细胞因子，包括内皮细胞白细胞粘附分子表 达。白细胞渗入缺血性脑损伤中，且抑制或减少TNF水平的化合物可用于 治疗缺血性脑损伤。参见Liu等人，Stroke, Vol. 25" No. 7, pp. 1481-88 (1994), 将其公开内容引入作为参考。
闭合性头部损伤的模型和用混合的5-LO/CO试剂治疗在Shohami等人， J. of Vaisc & Clinical Physiology and Pharmacology, Vol. 3， No. 2, pp. 99-107 (1992)中讨论。发现了减少水肿形成的治疗，从而改善在那些治疗的动物中 的功能结果。
本发明化合物以足以抑制IL-8结合至IL-8 a或(3受体的量给药，如通 过嗜中性粒细胞趋化性和激活减少来证明抑制与这些受体的结合。本发明化 合物为IL-8结合的抑制剂的发现是基于本发明化合物在体外测试的作用。
如在此使用的术语"IL-8介导的疾病或疾病状态"是指在其中IL-8、 GROa、 GRO(3、 GROy、 NAP-2或ENA-78通过以下方式起作用的任一以及 全部疾病状态通过其本身生成IL-8、 GROa、 GROf3、 GROy、 NAP-2或 ENA-78，或通过IL-8、 GROa、 GRO卩、GROy、 NAP-2或ENA-78引起别的 单核因子被释放，该单核因子例如但不限于IL-1、 IL-6或TNF。疾病状态，
li其中例如IL-1为主要组分，且其产生或作用随IL-8而加剧或分泌，因此可 认为是IL-8介导的疾病状态。
如在此使用的术语"趋化因子介导的疾病或疾病状态"是指其中结合至 IL-8 a或p受体的趋化因子起作用的任一以及全部疾病状态，该趋化因子例 如但不限于IL-8、 GRO-a、 GRO-P、 GRO-y、 NAP-2或ENA-78。这将包括 下述疾病状态，其中IL-8通过本身产生IL-8起作用或通过IL-8引起别的单 核因子被释》文起作用，该单核因子例如但不限于IL-1、 IL-6或TNF。疾病状 态，其中例如IL-1为主要组分，且其产生或作用随IL-8而加剧或分泌，因 此可认为是IL-8介导的疾病状态。
如在此使用的，术语"细胞因子"是指任一影响细胞功能的分泌的多肽， 且为调节细胞在免疫、炎性或造血反应中细胞间相互作用的分子。细胞因子 包括，但不限于，单核因子和淋巴因子，而不考虑何种细胞产生它们。例如， 单核因子通常是指由单核细胞(例如巨噬细胞和/或单核细胞)产生和分泌。许 多其它细胞也产生单核因子，例如自然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细 胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、脑星形细胞、骨髓基质细胞、表皮角化细胞 和B-淋巴细胞。淋巴因子通常是由淋巴细胞产生的。细胞因子的实例包括， 但不限于，白介素-1 (IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因 子-a (TNF-a)和肿瘤坏死因子(3 (TNF-卩)。
如在此使用的术语"趋化因子"是指任一影响细胞功能的分泌的多肽，且 为调节免疫、炎性或造血反应中的细胞间的相互作用的分子，类似于上述术 语"细胞因子"。趋化因子主要通过细胞跨膜分泌，并引起特定的白细胞和粒 细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、T-细胞、B-细胞、内皮细胞和 平滑肌细胞的趋化性和活化。趋化因子的实例包括，但不限于，IL-8、 GRO-a、 GRO-卩、GRO-y、 NAP-2、 ENA-78、 IP-10、 MIP-la、 MIP-卩、PF4和MCP1、 2和3。
为在治疗中使用本发明化合物，通常将其根据标准药物实践配制成药物 组合物。因此，本发明还涉及包含有效的、无毒性量的本发明化合物以及可 药用载体或稀释剂的药物组合物。
本发明化合物和掺入其的药物组合物可通过任何常规给药途径方便地 给药，例如口服、局部、肠胃外或吸入给药。本发明的化合物可以常规剂型 给药，该常规剂型根据常规方法将本发明化合物与标准药物载体组合而制备。本发明的化合物可以常规剂量与已知的第二治疗活性化合物组合给药。 这些方法可包括视情况混合、制粒和压片或溶解成分以形成所需的制剂。应 理解可药用载体或稀释剂的形式和特征由与其组合的活性成分的量、给药途 径和其它已知变量而指示。该载体必须是"可接受的"，能与其它制剂成分 相容且不有害于其接受者。
该使用的药物载体可为，例如固体或液体。固体载体的实例为乳糖、石 膏、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液 体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地，该载体或稀释剂可
包括现有技术已知的延时(time delay)物质，例如单独的甘油单硬脂酯或甘油 二硬脂酯或与蜡组合。
可使用许多类型的药物形式。因此，如果使用固体载体，该制剂可^^皮压 片以粉末或小丸形式置于硬明胶胶嚢中，或以含片(troche)或锭剂形式。固体 载体的量可有很大改变但优选为约25mg至约lg。当使用液体载体，该制剂 为糖浆、乳剂、软胶胶嚢、注射用无菌液体如安瓿或非水液体混悬液形式。
本发明的化合物可局部给药，即非全身给药。这包括外部施用本发明化 合物于表皮或口腔，和将这种化合物滴入耳、眼和鼻，以使该化合物不大量 地进入血流中。相反，全身给药是指口服、静脉内、腹腔内和肌内给药。
适用于局部给药的制剂包括适用于穿透皮肤进入炎症位点的液体或半 液体制剂，例如搽剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂，和适用于给药于眼、耳或 鼻的滴剂。该活性成分可占用于局部给药的制剂的0.001%至10%w/w,例 如1%至2%重量。然而其可占制剂的高达10% w/w， ^f旦优选占小于5% w/w, 更优选为制剂的0.1%至1% w/w。
根据本发明的洗剂包括那些适于施用于皮肤或眼的洗剂。眼洗剂可包含 任选含杀菌剂的无菌水溶液，且可按类似于制备滴剂的方法制备。施用于皮 肤的洗剂或搽剂可包括促进干燥和冷却皮肤的试剂，例如醇或或丙酮，和/ 或湿润剂例如甘油或油(如蓖麻油或花生油)。
根据本发明的乳剂、软膏或糊剂为用于外敷的活性成分的半固体制剂。 可通过将以细粒或粉末形式的活性成分单独或在水性或非水性液体中的溶 液或悬浮液中进行混合而制备它们，并借助合适的机械装置，借助油脂性基 质或非油脂性基质。该基质可包括烃类，如硬石蜡、软石蜡或液体石蜡、甘 油、蜂蜡、金属皂；粘质；天然源的油，如扁桃仁油、玉米油、花生油、蕙麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸如硬脂酸或油酸与如丙二醇的 醇或大粒凝胶。该制剂可掺入任何合适的表面活性剂，如阴离子表面活性剂、 阳离子表面活性剂或非离子表面活性剂，如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍 生物。也可包含悬浮剂如天然胶、纤维素衍生物或无机物，如硅质二氧化硅
(silicaceous silicas),禾口其它成分i口羊毛月旨。
根据本发明的滴剂可包括无菌水性或油性溶液或悬浮液，且可通过将活 性成分溶解在杀菌的和/或杀真菌的试剂和/或任何其它合适的防腐剂的合适 水溶液中而制备，且优选包括表面活性剂。然后可通过过滤将所得溶液澄清， 转移至合适的容器中，然后密封并通过高压灭菌或在98-100°C保持半小时 而灭菌。或者，可通过过滤灭菌溶液并通过无菌操作转移至容器中。适用于 加入滴剂中的杀菌和杀真菌的试剂的实例为硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002%)、 苯扎氯铵(0.01%)和醋酸洗必泰(0.01%)。制备油性溶液的合适溶剂包括甘油、 稀释的醇和丙二醇。
可肠胃外给药本发明的化合物，即通过静脉内、肌内、皮下、鼻内、直 肠内、阴道内或腹腔内给药。这种给药的适当的剂型可通过常规方法制备。 本发明的化合物也可通过吸入给药，即通过鼻内和口腔吸入给药。这种给药 的合适剂型，如气雾剂或计量剂量气雾剂可通过常规方法制备。
对于所有在此公开的本发明的化合物的使用方法，每日口服剂量方案优 选总体重的约0.01至约80 mg/kg。每日肠胃外剂量方案优选总体重的约 0.001至约80 mg/kg。每日局部剂量方案优选0.1 mg至150 mg，给药1至4 次/日，优选2或3次/日。每日吸入剂量方案优选每日约0.01 mg/kg至约l mg/kg。本领域技术人员也应理解本发明化合物的最佳量和每次给药的间隔 将由治疗的疾病的性质和程度，给药形式、途径和位点，和具体治疗的病人 而确定，且这些最佳方案可通过常规技术而确定。本领域技术人员也应理解 治疗的最佳过程，即对于限定天数的每天给予的本发明化合物的剂量的次 数，其可通过本领域技术人员使用治疗确定检测的常规过程而确定。
组合
根据本发明的化合物和药物制剂可与 一 种或多种其它治疗剂组合使用 或包括一种或多种其它治疗剂，该一种或多种其它治疗剂例如选自抗炎药、 抗胆碱能药(特别是M,/M2腺3受体拮抗剂)、(32-肾上腺素受体激动剂、抗感
14染药(如抗生素)、抗病毒剂或抗组胺药。因此本发明另一方面提供组合，其 包括本发明化合物或其生理功能性衍生物与 一种或多种治疗活性药物，例如
选自抗炎药(如皮质类固醇或NSAID)、抗胆碱能药、P2-肾上腺素受体激动剂、
抗感染药(如抗生素)或抗病毒剂或抗组胺药。本发明一个实施方案包括组合，
其包含本发明化合物或其生理功能性衍生物与「」2-肾上腺素受体激动剂和/或
抗胆石威药，和/或PDE-4抑制剂和/或抗组胺药。
对本领域技术人员清楚的是，视需要其它治疗成分可以盐形式使用，例 如作为碱金属或胺盐或作为酸加成盐，或前药，或酯(例如低级烷基酯)，或 作为溶剂合物(例如水合物)，以优化治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特 性(如溶解性)。同样清楚的是，视需要可将治疗成分以光学纯形式使用。
在一个实施方案中，本发明包括含有本发明化合物和112-肾上腺素受体
激动剂的组合。(32-肾上腺素受体激动剂的实例包括沙美特罗(其可为外消旋 化合物或单一对映异构体，如i -对映异构体)、沙丁胺醇(其可为外消旋化合 物或单一对映异构体，如7 -对映异构体)、福莫特罗(其可为外消旋化合物或 单一非对映异构体，如尺7 -非对映异构体)、沙曱胺醇、非诺特罗、卡莫特 昔罗、依坦特罗、那明特罗、克仑特罗、吡布特罗、氟丁特罗、瑞普特罗、 班布特罗、吲哚卡特罗(indacaterol)、特布他林及其盐，例如沙美特罗的昔萘 酸盐(l-羟基-2-萘曱酸盐)、沙丁胺醇的硫酸盐或游离碱或福莫特罗的富马酸 盐。在一个实施方案酯，所述|32-肾上腺素受体激动剂为长效(32-肾上腺素受 体激动剂，例如，提供有效支气管扩张约12小时或更长的化合物。其它|32-肾上腺素受体激动剂包括那些公开于WO2002/066422、 WO2002/070490、 WO2002/076933 、 WO2003/024439 、 WO2003/072539 、 WO2003/091204 、 WO2004/016578、 WO2004/022547 、 WO2004/037807 、 WO2004/037773 、 WO2004/037768 、 WO2004/039762 、 WO2004/039766 、 WO2001/42193和 WO2003/042160中的激动剂。
(32-肾上腺素受体激动剂的其它实例包括
3-(4-{[6-({(211)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟基曱基)苯基]乙基}氨基)己基]氧
基}丁基)苯磺酰胺；
3- (3-{[7-({(211)-2-羟基-2-[4-羟基-3-羟基曱基)苯基]乙基}-氨基)庚基]氧 基}丙基)苯磺酰胺；
4- {(111)-2-[(6-{2-[(2，6-二氯苄基)氧基]乙氧基}己基)氨基]-l-羟基乙基}-2-(羟基曱基)苯酚；
4_{(111)-2-[(6-{4-[3-(环戊基磺酰基)苯基]丁氧基}己基)氨基]-1-羟基乙 基}-2-(羟基曱基)苯酚；
N-[2-羟基-5-[(lR)-l-羟基-2-[[2-4-[[(2R)-2-羟基-2-苯基乙基]氨基]苯基]
乙基]氨基]乙基]苯基]曱酰胺；
N-2(2-[4-(3-苯基-4-曱氧基苯基)氨基苯基]乙基}-2-羟基-2-(8-羟基 -2(1H)-p奎啉酮(quinolinon)-5-基)乙基胺；和
5-[(R)-2-(2-{4-[4-(2-氨基-2-曱基-丙氧基)-苯基氨基]-苯基}-乙基氨基)-l-羟基-乙基]-8-羟基-lH-喹啉-2-酮。
该[]2-肾上腺素受体激动剂可以为与可药用酸形成的盐的形式，该可药 用酸选自硫酸、盐酸、富马酸、羟基萘酸(例如1-或3-羟基-2-萘酸)、肉桂酸、 取代的肉桂酸、三苯基乙酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、萘丙烯酸、苯曱酸、 4-曱氧基苯曱酸、2-或4-羟基苯曱酸、4-氯苯甲酸和4-苯基苯曱酸。
合适的抗炎药包括皮质类固醇。可用于与本发明化合物组合的皮质类固 醇的实例是那些口服和吸入的皮质类固醇及其具有抗炎活性的前药。
实例包括曱基泼尼松龙、泼尼松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6oc，9a-二氟-ll(3-羟基-16ot-曱基-17a-[(4-曱基-l,3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄 (androsta)-l，4-二晞-17P-硫代羧酸S-氟曱基酯、6a,9a-二氟-17a-[(2-呋喃基羰 基)氧基]-ll卩-羟基-16ot-曱基-3-氧代-雄-l，4-二烯-17卩-硫代羧酸S-氟曱基酯 (糠酸氟替卡松)、6",901-二氟-11(3-羟基-1601-曱基-3-氧代-1701-丙酰氧基-雄 —1，4-二烯-17P-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯、6a,9a-二氟-lip-羟基 -1601-曱基-3-氧代-17(1-(2,2，3，3-四曱基环丙基羰基)氧基-雄-1,4-二烯-17卩-硫 代羧酸S-氰基曱基酯和6a,9a-二氟-lip-羟基-16a-曱基-17a-(l-曱基环丙基 羰基)氧基-3-氧代-雄-l，4-二烯-17P-硫代羧酸S-氟曱基酯、倍氯米松酯(例如 17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼缩+>、莫米松酯(例如莫米松 糠酸酯)、曲安奈德、罗氟奈德、环索奈德(16cc,17-[[(R)-环己基亚曱基]双(氧 基)]-11(3，21-二羟基-孕甾-1，4-二烯-3,20-二酮)、布替可特丙酸酯、RPR-106541 和ST-126。在一个实施方案中皮质类固醇包括丙酸氟替卡松、6a，9ot-二氟 -11P-羟基-16a-曱基-17a-[(4-曱基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄-1,4-二烯 -17卩-硫代羧酸S-氟曱基酯、6a，9a-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧基]-lip-羟基 -1606-曱基-3-氧代-雄-1,4-二烯-17(3-硫代羧酸S-氟甲基酯、601，901-二氟-11|3-羟基-16ot-曱基-3-氧代-17a-(2，2，3，3-四曱基环丙基羰基)氧基-雄-l,4-二烯 -17(3-硫代羧酸S-氰基甲基酯和6a，9oc-二氟-ll卩-羟基-16cx-曱基-17(x-(l-曱基 环丙基羰基)氧基-3-氧代-雄-l，4-二烯-17(3-硫代羧酸S-氟曱基酯。在一个实施 方案中该皮质类固醇为6a,9ot-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧基]-lll3-羟基 -16a-曱基-3-氧代-雄-1,4-二烯-17P-硫代羧酸S-氟曱基酯。
皮质类固醇的实例包括那些公开于WO2002/088167、 WO2002/100879、 WO2002/12265 、 WO2002/12266 、 WO2005/005451 、 WO2005/005452 、 WO2006/072599和WO2006/072600中的皮质类固醇。
具有糖皮质激素激动作用(agonism)并可具有对转活(transacti vation)的反 式阻抑作用(transrepression)选择性、且可用于组合治疗的非甾体化合物包括 那些在以下开的专利申请和专利中所涉及的WO2003/082827 、 W01998/54159 、 WO2004/005229 、 WO2004/009017 、 WO2003/104195 、 WO2003/082787 、 WO2003/082280 、 WO2003/101932 、 WO2002/02565 、 WO2001/16128 WO2003/086294 、 WO2004/026248 、 WO2003/061651 WO2006/000401、 WO2006/000398和WO2006/015870。
具有糖皮质激素激动作用可具有对转活的反式阻抑作用选择性、且可用 于组合治疗的非甾体化合物包括那些在以下专利中所涉及的 WO2003/082827 、 W01998/54159 、 WO2004/005229 、 WO2004/009017 、
WO2003/104195 、 WO2003/082787 WO2003/101932 、 WO2002/02565 WO2003/086294 、 WO2004/026248 、
WO2004/018429 、 WO2003/059899 、 WO2000/66590 、 WO2003/08277 、
WO2004/018429 WO2003/059899 WO2000/66590 、
WO2003/082280 、 WO2001/16128 、 WO2003/061651和
W02003/08277。
抗炎药的实例包括非甾体抗炎药(NSAID，s)。 NSAID，s的实例包括色甘酸钠、奈多罗米钠、
喊一
酯酶(PDE)抑制剂
(例如，茶碱、PDE4抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂)、白细胞三烯拮抗 剂、白细胞三烯合成的抑制剂(例如孟鲁司特)、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和 弹性蛋白酶抑制剂、P-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如腺 苷2a激动剂)、细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂，如CCR3拮抗剂)或 细胞因子合成的抑制剂或5-脂加氧酶抑制剂。在一个实施方案中，本发明包 括用于口服给药的iNOS (可诱导性一氧化氮合酶)抑制剂。iNOS抑制剂的实
17例包括那些公开于WO1993/13055 、 WO1998/30537 、 WO2002/50021 、 W01995/34534和W01999/62875中的。CCR3抑制剂的实例包括那些公开 于WO2002/26722中的CCR3抑制剂。
在一个实施方案中，本发明提供使用本发明的化合物与磷酸二酯酶4 (PDE4)抑制剂的组合，例如在适用于吸入的制剂的情况。该用于本发明该方 面的PDE4抑制剂可为任何已知的化合物或公开作为PDE4抑制剂，例如作 为PDE4B和/或PDE4D抑制剂。
PDE4抑制化合物包括顺式-4-氰基-4-(3-环戊基氧基-4-曱氧基苯基)环己 烷-1 -羧酸、2-曱酯基-4-氰基-4-(3-环丙基曱氧基-4-二氟曱氧基苯基)环己烷-1 -酮和顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基曱氧基-4-二氟曱氧基苯基)环己烷-1 -醇]。还包 括顺式-4-氰基-4-[3-(环戊基氧基)-4-甲氧基苯基]环己烷-l-羧酸(也已知为西 洛司特)及其盐、酯、前药或物理形式，其描述于美国专利5,552,438。
其它PDE4抑制化合物包括源自Elbion (Hofgen， N.等人15th EFMC Int Symp Med Chem (Sept 6-10， Edinburgh) 1998， Abst P.98中的AWD-12-281 (N-(3,5-二氯-4-吡啶基)-l-[4-氟苯基)曱基]-5-羟基-a-氧代-lH-吲哚-3-乙酰 胺)；CAS参考No. 247584020-9);命名为NCS-613 (INSERM)的9-千基腺噤 呤衍生物；源自Chiroscience和Schering-Plough的D-4418;产自Pfizer的称 为CI-1018 (PD-168787)的苯并二氮杂萆PDE4抑制剂；由Kyowa Hakko公开 于W099/16766的苯并二氧杂环戊烯衍生物；源自Kyowa Hakko的K-34; 源自Napp (Landells, L丄等人Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (Sept 19-23， Geneva) 1998] 1998, 12 (Suppl. 28): Abst P2393)的V-11294A;罗氟司 特(roflumilast) (3-(环丙基曱氧基)-N-(3，5-二氯-4-吡啶基)-4-(二氟曱氧基)苯曱 酰胺)(参见Byk Gulden Lomberg的EP 0 706 513 Bl,例如参见其实施例5); 源自Byk-Gulden的2，3-二氮杂萘S同(WO1999/47505);普马芬群(Pumafentrine), (_)_p_[(4aR*,10bS*)-9-乙氧基-l,2，3，4,4a，10b-六氢-8-曱氧基-2-曱基苯并[c][1,6] 萘啶-6-基]-N,N-二异丙基苯曱酰胺，其为混合的PDE3/PDE4抑制剂，由 Byk-Gulden制备和公开，目前Altana;由Almirall-Prodesfarma正在研发的 阿罗茶石威；源自Vernalis的VM554/UM565;或T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji, K.等人J Pharmacol Exp Ther，1998， 284(1): 162)和T2585。
其它的PDE4抑制化合物公开于公开的国际专利申请WO2004/024728、 WO2004/056823、 WO2004/103998 (例如其中公开的实施例3"或5")、WO2005/058892、 WO2005/090348、 WO2005/090353和WO2005/090354,全 部都以Glaxo Group Limited的名义。
抗胆碱能药的实例为那些在毒蕈碱受体作为拮抗剂的化合物，尤其是那 些作为或M3受体的拮抗剂的化合物、M,/M3或M2/M3受体的双重拮抗剂 或M!/M乂M3受体的泛-拮抗剂。经吸入给药的示例性化合物包括异丙托铵 (ipratropium)(例如，作为溴化物，CAS 22254-24-6,以Atrovent名称卖)，氧 托铵(oxitropium)(例如作为溴化物，CAS 30286-75-0)和p塞托铵(tiotropium) (例如，作为溴化物，CAS 136310-93-5，以Spiriva名称卖)。同样感兴趣的 为瑞伐托酯(例如，作为氢溴化物，CAS 262586-79-8)和LAS-34273，其公开 于WO2001/04118 。 口服给药的示例性化合物包括哌仑西平(CAS 28797-61-7)、达非那新(以Enablex名称销售的氪溴化物CAS 133099-04-4或 CAS 133099-07-7)、奥昔布宁(CAS 5633-20-5，以Ditropan名称销售)、特罗 地林(CAS 15793-40-5)、托特罗定(其酒石酸盐CAS 124937-51-5或CAS l24937-52-6，以Detrol名称销售)、奥替铵(otilonium)(例如，作为溴化物CAS 26095-59-0，以Spasmomen名称销售)、曲司氯铵(CAS 10405-02-4)和 solifenacin (其琥珀酸盐CAS 242478-37-1或CAS 242478-38-2,也已知为 YM-卯5,且以Vesicare名称销售)。
其它化合物7>开于WO 2005/037280 、 WO 2005/046586和WO 2005/104745。本发明的组合包括，但不限于
(3-内)-3-(2,2-二-2-噻吩基乙烯基)-8，8-二曱基-8-氮镜杂双环[3.2.1]辛烷 碘化物；
(3-内)-3-(2-氰基-2,2-二苯基乙基)-8,8-二曱基-8-氮镜杂双环[3.2.1]辛烷
溴化物；
4-[羟基(二苯基)曱基]-1-{2-[(苯基曱基)氧基]乙基}-1-氮镥杂双环[2.2.2]
辛烷溴化物；和
(1凡55>3-(2-氰基-2,2-二苯基乙基)-8-曱基-8-{2-[(苯基曱基)氧基]乙 基}-8-氮像杂双环[3.2.1]辛烷溴化物。
其它抗胆碱能药包括公开于美国专利申请60/487981的化合物，将其以 本发明实际需要的程度在此引入作为参考。这些包括，例如
(内)-3-(2-曱氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二曱基-8-氮镥杂-双环 [3.2.1]辛烷碘化物；3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙腈； (内)-8-曱基-3-(2，2，2-三苯基-乙基)-8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷； 3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酰胺； 3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙酸； (内)-3-(2-氰基-2,2-二苯基-乙基)-8,8-二曱基-8-氮镜杂-双环[3.2.1]辛烷 碘化物；
(内)-3-(2-氰基-2,2-二苯基-乙基)-8,8-二曱基-8-氮镜杂-双环[3.2.1]辛烷
溴化物；
，//nh人o TS7计 o 各九 =7<7 fTr， o 1 l立，甘人，，—^计 工1 Sit. J—Vlr，J广o- T公-0-炎、tK-,八^I、LJ.厶1 j T -J-公广一丄-^4、公一 KV-丄-畔，
N-千基-:3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.l]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酰胺； (内)-3-(2-氨基曱酰基-2,2-二苯基-乙基)_8,8-二曱基-8-氮锱杂-双环[3.2.1]
辛烷碘化物；
1-苄基-3-[3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-
脲；
1-乙基-3-[3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-
脲；
N-[3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-乙酰胺； N-[3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯曱酰
胺；
3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二-噻吩-2-基-丙腈； (内)-3-(2-氰基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基)-8,8-二曱基-8-氮镜杂-双环[3.2.1]
辛烷碘化物；
N-[3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯磺酰
胺；辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-脲； N-[3-((内)-8-曱基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-曱磺酰 胺；和/或
(内)-HH二苯基-H(i-苯基-曱酰基)-氨基]-丙基H,8-二曱基-8-氮條
杂-双环[3.2.1]辛烷溴化物。 其它化合物包括
(内)-3-(2-曱氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8,8-二曱基-8-氮锴杂-双环[3.2.1]辛烷碘化物；
(内)-3-(2-氰基-2,2-二苯基-乙基)-8，8-二曱基-8-氮镥杂-双环[3.2.1]辛烷 碘化物；
(内)-3-(2-氰基-2,2-二苯基-乙基)-8，8-二曱基-8-氮镥杂-双环[3.2.1]辛烷
溴化物；
(内)-3-(2-氨基曱酰基-2,2-二苯基-乙基)-8,8-二甲基-8-氮镜杂-双环[3.2.1]
辛烷碘化物；
(内)-3-(2-氰基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基)-8,8-二曱基-8-氮條杂-双环[3.2.1]
t ,w^ / iv J乙. j:— / 4: 卞机WU， ， 4w/^入
(内)-3-{2,2-二苯基-3-[(1-苯基-曱酰基)-氨基]-丙基}-8,8-二曱基-8-氮锱 杂-双环[3.2.1]辛烷溴化物。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明化合物与Hl拮抗剂的组合。 Hl拮抗剂的实例包括，但不限于，氨来P占诺(amelexanox)、阿司咪唑、阿扎 他定、氮卓斯汀、阿伐斯汀、溴苯那敏、西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪、' 氯苯那^:、氯马斯汀、赛克力嗪、卡瑞斯汀、赛庚啶、卡比沙明、地洛他定 (descarboethoxyloratadine)、多西拉敏、二曱茚定、依巴斯汀、依匹斯汀、乙 氟利嗪、非索非那定、羟嗪、酮替芬、氯雷他定、左卡巴斯汀、咪唑斯汀、 美喹他嗪、米安色林、诺柏斯汀、美克洛。秦、诺阿司咪唑、奥洛他定、哌香 豆司特、美吡拉敏、异丙嗪、特非那定、曲吡那敏、替美斯汀、阿利马。秦和 曲普利啶，特别是西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪和非索非那定。在另一 实施方案中，本发明提供包含本发明化合物与H3拮抗剂(和/或反激动剂)的 组合。H3拮抗剂的实例包括，例如，那些公开于WO2004/035556和 WO2006/045416的化合物。其它可与本发明的化合物组合4吏用的组胺受体拮 抗剂包括H4受体的拮抗剂(和/或反激动剂)，例如公开于Jablonowski等人，J. Med. Chem. 46:3957-3960 (2003)的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明化合物与CCR5受体拮抗剂 的组合，该受体拮抗剂如4，4-二氟-N-((lS)-3-(3-[3-曱基-5-(l-曱基乙 基)-4H-l，2，4-三唑-4-基]-8-氮杂二环[3.2.1]辛-8-基H-苯基丙基)环己烷甲酰 胺(carboxamide):
21在一个实施方案中，本发明提供包含本发明化合物与CXCR3受体拮抗
剂如^((111)-1-{3-[4-(乙氧基)苯基]-4-氧代-3,4-二氢吡啶并[2,3-司嘧啶-2-基} 乙基)-N-(3-吡啶基曱基)-2-(4-[(三氟曱基)氧基]苯基)乙酰胺的组合
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与PDE4抑制剂的组合。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与n2-肾上腺素受体 激动剂的组合。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与皮质类固醇的组合。 因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与非甾体GR激动剂 的组合。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与抗胆碱药的组合。 因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与抗组胺药的组合。 因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与PDE4抑制剂和|32-
肾上腺素受体激动剂的组合。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与抗胆碱药和PDE-4
抑制剂的组合。
上述组合可以方便地以药物制剂的形式提供使用，因此包含上述组合与可药用稀释剂或载体的药物制剂代表本发明的另 一 方面。
药。在一个实施方案中，该单个的化合物将在组合的药物制剂中同时给药。 本领域技术人员将易于理解已知治疗剂的合适剂量。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与其它治疗活性剂组 合的药物组合物。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与PDE4抑制剂组合 的药物组合物。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与L」2-肾上腺素受体 激动剂组合的药物组合物。
因此，在另一方面，本发明提供包含本发明化合物与皮质类固醇组合的 药物组合物。
因此，在另一方面， 组合的药物组合物。
因此，在另一方面， 物组合物。
因此，在另一方面， 物组合物。
因此，在另一方面 剂组合的药物组合物。
因此，在另一方面， 组合。
本发明将参考以下生物实施例进行描述，其仅仅为示例性的，而不作为 对本发明范围的限制。
本发明提供包含本发明化合物与非甾体GR激动剂 本发明提供包含本发明化合物与抗胆碱药组合的药 本发明提供包含本发明化合物与抗组胺药组合的药 本发明提供包含本发明化合物与CXCR3受体拮抗 本发明提供本发明与CCR5受体拮抗剂组合的药物
生物实施例
本发明化合物的IL-8和GRO-a趋化因子抑制作用通过以下体外测试确
定:
受体结合测定 il-8 (人重组体)得自GE Healthcare,具有特异性活性2000Ci/mmol。所有其它化学品为分析级。高水平的重组体人CXCR1 (a型IL-g和 U入CK2 (卩SI 1L-8艾停合目在非贴笠的T闺1L、氟9卩果(Uiinese Hamster (Jvary, CHO)细胞中表达，如先前所述(Holmes,等人，Science, 1991, 1278)。根据 先前所述的方案(Haour，等人，J. Biol. Chem., 249 pp 2195-2205 (1974))制备 膜，引入该方案参考以制备本发明的膜，除了匀浆緩冲液改为40mM Tris-HCL (pH 7.5)、 ImM MgS04、 0.5 mM EGTA (乙二醇-双(2-氨基乙基 醚)-N,N，N，,N，-四-乙酸)、ImM PMSF (a-曱笨磺酰氟)、2.5 mg/L亮抑酶肽和 0.1 mg/ml抑肽酶。将细胞匀浆并在2,000 rpm离心10分钟。上清液在100,000 x g离心1小时。去除上清液并将膜保存在-8(TC。使用BioRad试剂根据制 造商方案使用胎牛血清白蛋白(BSA)作为标准测定膜蛋白浓度。
所有IL-8结合使用亲近闪烁4企测(Scintillation Proximity Assays, SPA)使 用麦胚凝集素珠以96-孔板模式进行。膜CHO-CXCR1或CHO-CXCR2在结 合緩沖液中在4。C与珠预培养30分钟。緩冲液包含20 mM Bis-Trispropane 緩沖液，pH 8.0，包含1 mM MgS04、 0.1 mM EDTA和25 mM NaCl。化合 物在DMSO中稀释，最终稀释为20X (终化合物浓度在1 nM至30 uM且终 DMSO浓度为5%)。试验在96孔板(optiplate 96， Packard)中在室温下在0.1 mL 含膜和0.04% CHAPS (3-[(3-胆酰胺丙基)二曱基氨基]-1-丙磺酸盐)、0.0025% BSA和0.23 nM [125I] IL-8的结合緩冲液中进行。将板在平台上摇动1小时， 在培养结束时，将板以2,000rpm离心5分钟，Top Count计数器进行计数。 所述的重组体IL-8 Ra、 CXCR1或I型受体在此也称为非允许受体，所述的 重组体IL-8 RP、 CXCR2或II型受体称为允许受体。
在该测试中如果化合物表现出IC50值<30uM，认为该化合物是有活 性的。在本发明的测试中，本发明化合物的检测活性为IC50值为约13nM。
趋化性测定
进行嗜中性粒细胞的趋化性测试。使用percoll不连续梯度离心、右旋糖 酐沉降和低渗裂解(hypotonic lysis)从外周全血分离原代人嗜中性粒细胞。将 化学引诱物IL-8 (CXCL8)或GRO-a (CXCLl)置于96多孔室(ChemoTx System, Neuro Probe， Gaithersburg, MD)的底室。4吏用的激动剂浓度为EC80 浓度。通过5 ium聚碳酸酯膜分隔两室。将待测化合物与细胞预培养，然后 置于滤器的上部。在加湿培养箱中于370C和5% C02下进行趋化性测试45分钟。在培养期间结束时，去除膜并使底室中迁移的细胞转移至96孔板中。
^f吏用发光细月包存活测试(Celltiter-Gl0， Promega， Madison, WI)测定这些细月包。 每种样品一式二份进行测试且每种化合物至少重复实验3次。阳性对照细胞 是没有添加化合物的细胞，且代表最大趋化反应。阴性对照(未刺激的)是在 底室中不添加趋化因子。阳性对照和阳性对照的差异表示细胞的趋化活性。 如果化合物的ICso值<5uM， _〖人为该化合物有活性。
CDllb人全血测定
测试化合物抑制GROa-诱导整联蛋白CDllb在人全血中的嗜中性粒细 胞上的表达的能力。
使用蝴蝶型管(butterfly line)和含有0.2 mL工作肝素钠(working Sodium Heparin)的10 ml注射器抽血(9 ml)。将血液保存在37°C,直到下面的步骤5 中放置在冰上为止。然后，将化合物储备溶液稀释至最大最终浓度的12倍， 120|uM。然后，在溶媒中进行半对数(HalfLog)系列稀释。然后，将10微升 该化合物稀释物或溶媒加入到适宜的12x75聚丙烯管中。每管加入IOO微升 全血并在37。C水浴中培养10分钟，该水浴开始时(温和)振荡并在5分钟时 再次振荡。将该GROa储备液在0.1%BSA-DPBS中稀释1:166.66至120nM 的"12x"浓度，接着将10ul的GROa稀释液或0.1% BSA-DPBS加入到适宜 的管中，这样最终的GROa浓度等于10nM。将这些管在37。C培养IO分钟， 最初温和地手动振荡并在5分钟时再次振荡。然后，将样品放在冰上，加入 250 pl水冷的CellFix工作稀释液，接着在水上培养1分钟。在GROa培养 期间，准备1.5 ml Eppendorf管，加入适宜的抗体。除同工型对照物接受10 的IgG2a-FITC而不是CDllb夕卜，每管接受10 pl的CDllb-FITC和5 jul的 CD16-PE。将每管中的50 )iL经固定的血液加入到适宜的Eppendorf管中。 然后，样品在4。C在黑暗中培养20分钟。将加入到500 jil冷DPBS中的血 液/抗体混合物加入到适当标记的12x75聚苯乙烯管中。所得混合物保持在冰 上。加入LDS储备液(IO uL)，接着将该混合物在4。C培养10分钟。接着进 行流式分析。将样品保存在黑暗环境中。使LDS的加入与样品在流式细胞 仪上的收集错开，这样所有样品在LDS加入后运行 10-20分钟。
使用中等介质流速进行流式收集且使用LDS信号增加FL3阈值以从分 析中除去红细胞。使用未标记的样品和单一颜色样品以减去LDS到PE中的溢出和该PE到FITC的溢出和FITC到PE的溢出，从而适当地设定颜色补 偿。对于BDLSR细胞计数器，LDS=FL3, PE=FL2, FITOFLl。收集SSC 对FSC满足粒细胞门并且FL2信号显示CD16阳性的最少2000-3000个事件。 如果化合物表现出ICso值<5jiM，认为该化合物有活性。
在稳定表达CXCR2和Gal6的CHO-K1细胞中的钩动员
稳定表达CXCR2和Gal6的CHO-K1细胞在DMEM/F12(HAM，s) 1:1 ， w/10% FCS (热灭活)，w/2 mM L-谷氨酰胺，w/0.4 mg/ml G418中生长至80% 汇合，同时在37。C 5% C02培养箱中培育。在试验前24小时，收获细胞并 以每孔40,000细胞铺板在96孔黑色壁、透明底的板(Packard View)中，接着 放回到C02培养箱中。在试验当天，化合物在100% DMSO中连续稀释至 300X所需的试验浓度。从细胞中吸出生长培养基并用100 juL负载培养基 (EMEM，含Earl"s盐w/L-谷氨酰胺，0.1% BSA,(来自Seriologicals公司的 Bovuminar Cohen Fraction V)、 4 氟-4-乙酰氧基曱基酯焚光指示剂染料 (Fluo-4 AM,来自Molecular Probes),和2.5 mM丙磺舒)替换，接着在37°C 在C02培养箱中培养1小时。吸出负载培养基，用100 uL含Earl"s盐w/L-谷氨酰胺、0.1%明胶和2.5 mM丙磺舒的EMEM替换，接着再培养10分钟。
mMNaCl， 4,6mMKCl， 1.03 mMKH2P04， 25mMNaHC03, 1.0mMCaCl2， l.lmM MgCl2， llmM葡萄糖，20 mM HEPES (pH 7.4)) w/2.5 mM丙磺舒和 0.1%明胶的96孔板中(化合物现在为3X)。从细胞中吸出培养基，细胞用KRH w/2.5 mM丙磺舒、w/0.P/。明胶洗涤3次。将含0.1%明胶的KRH(100 ul) w/2.5 mM丙磺舒加入到孔中，然后将50 ul在KRH w/2.5 mM丙磺舒和0.1%明胶 中的3X化合物加入到孔中(化合物现在为1X)，接着在37。C在C02培养箱中 培养10分钟。将板放到FLIPR上(荧光成像板读数器(Fluorometric Imaging Plate Reader), Molecular Devices, Sunnyvale CA)进4亍之前所述的分冲斤(Sarau 等人，1999)。对于化合物每一浓度，分别测定相对于由1.0nMIL-8(CXCR2 的EC80浓度)所诱导的最大人IL-8诱导的Ca"动员(maximal human IL-8-induced Ca2+ mobilization)的百分比，并计算IC5o，所述ICs()为抑制1.0 nM IL-8诱导的最大应答的50%的测试化合物浓度。如果化合物表现出ICso值 <10uM，认为该化合物具有活性。向大鼠口服给药后的嗜中性粒细胞CDllb刺激
向Lewis大鼠(250-300 gm)口服给药本发明化合物或溶媒，1小时后， 将大鼠用C02窒息处死。在含有100 }il的0.25 M EDTA (GIBCO， Grand Island, NY)的注射器中通过心脏穿刺抽取大鼠全血3 ml。通过在Kreb's/0.1% BSA (KBSA)中，以10 (iM重构制备大鼠CXCL2 (PeproTech， Rocky Hill， NJ)储备 液。将该储备液稀释至"llx"在DPBS (GIBCO)中使用的最大浓度，并在 KBSA/DPBS溶媒中系列稀释。将10 pl适当浓度的本发明化合物(1.2 - 100 nM)或溶J 某加到12x75 mm聚丙烯管中，然后加入100 全血。将这些管在 37。C浴中培育30分钟，同时每10分钟进行轻微手动搅拌。然后将样品置 于冰上保持10分钟，接着加入10 jil抗-大鼠-CDllb-FITC或FITC-标记的小 鼠IgG2a同工型对照(均来自Antigenix America, Huntington Station, NY)，并 在冰上培育30分钟。加入1 ml的IX FACS裂解溶液(Becton Dickinson, San Jose，CA)，，同时马上剧烈涡旋，然后将溶液加入到最终样品中后重涡旋。将 样品在室温下培育10分钟，且以 300 x g沉淀白细胞并用DPBS洗涂。将细 胞再悬于650 pi的1%多聚曱醛(paraformaldahyde)中。FACS裂解溶液没有完 全裂解大鼠红细胞。因此，对于流式细胞检测分析，将3.5 [il的1.67 mg/ml LDS-751 (Exciton, Dayton, OH)的乙醇溶液(过饱和；通过离心澄清)力口入到每 个样品中，在1-2分钟流动分析内排除任何残留红细胞。使用CellQuest软 件和LSR流式细胞计数器(Becton-Dickinson)收集样品数据，在低流速设置 下，通过增加FL3阈值排除LDS-751阴性红细胞，然后在相对散射方向的 一侧收集嗜中性粒细胞。通过用CellQuest软件分析检测这些嗜中性粒细胞 的FL1 (绿色FITC焚光，直接涉及CDllb含量)(为平均通道焚光)。
在本发明的测试中，向Lewis大鼠以10 mg/kg给药后，测试本发明化合 物抑制全血嗜中性粒细胞CDllb表达的活性。本发明化合物显著地改变了 CXCL2的EC50,浓度响应曲线从用溶媒治疗大鼠的4.7 nM (1.9 - 7.4; 95% C丄)改变为12.3 nM (10.0 - 14.7)， (p<0.001,每组『6)。
上面的说明充分公开了本发明，包括其优选实施方案。本文特别公开的 实施方案的变化和改进都在权利要求的范围之内。 一般认为，本领域技术人 员不需要更多的发挥，根据前面的说明就可以最大程度地利用本发明。因此，
27在此的实施例仅仅是举例说明，而不是以任何方式限定本发明的范围。其中 要求保护排他权或特权的本发明实施方案在权利要求书中进行了定义。
权利要求
1. 化合物，其为N-[4-氯-2-羟基-3-(哌嗪-1-磺酰基)苯基]-N′-(2-氯-3-氟苯基)脲对甲苯磺酸盐。
2. 药物组合物，其包含N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺酰基)苯基]->^'-(2-氯-3-氟苯基)脲对曱苯磺酸盐和可药用载体或稀释剂。
3. —种治疗趋化因子介导的疾病的方法，其中在哺乳动物中该趋化因 子与IL-8 。或ci受体结合，该方法包括给药有效量的N-[4-氯-2-羟基-3-(哌溱 -1 -磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3 -氟苯基)脲对曱苯磺酸盐。
4. 一拙、、厶、A oln^ ，M" IT曰堂，lv+缺、左a A:义口主口r 念；6 ^irytv么t AA方法包括向有此需要的哺乳动物给药有效量的N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺 酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基)脲对曱苯磺酸盐。
5. —种治疗慢性阻塞性肺病的方法，该方法包括向有此需要的哺乳动 物给药有效量的N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基)脲对曱苯磺酸盐。
6. N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基)脲对曱苯 磺酸盐在制备用于治疗趋化因子介导的疾病的药物中的用途。
7. N-[4-氯-2-羟基-3-(哌。秦-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基)脲对曱苯磺酸盐在制备用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺病或成人呼吸窘迫综合征的药物 中的用途。
8. N-[4-氯-2-羟基-3-(哌溱-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基)脲对甲苯 磺酸盐在制备用于治疗慢性阻塞性肺病的药物中的用途。
9. 药物组合物，其包含N-[4-氯-2-羟基-3-(哌溱-l-磺酰基)苯基]-N'-(2-氯-3-氟苯基)脲对曱苯磺酸盐和一种或多种其它治疗成分。
10. 权利要求10的组合物，其中所述其它治疗成分为CXCR3受体拮 抗剂或CCR5受体拮抗剂。
11. 一种制备N-[4-氯-2-羟基-3-(4-曱基-哌。秦-l-磺酰基)-苯基]-N'-(2-氯 -3-氟苯基)脲对曱苯磺酸盐的方法，该方法包括下述步骤a) 将乙腈和对曱苯磺酸一水合物混合；b) 将步骤a)的产物加入到溶于四氢呋喃的<formula>formula see original document page 3</formula>C)用乙腈处理步骤b)中得到的产物。
全文摘要
本发明涉及新的化合物及其组合物，在治疗由趋化因子白介素-8(IL-8)介导的疾病状态中的用途。
文档编号A01N43/00GK101505595SQ200780031405
公开日2009年8月12日 申请日期2007年6月22日 优先权日2006年6月23日
发明者克里斯托弗·S·布鲁克, 爱德华·C·韦布, 理查德·M·古德曼, 雅各布·布施-彼得森 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司