专利名称：一株坚强芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株坚强芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术：
种植业每年因病虫害造成巨大的损失。病虫害的防治有多种方法，化学防治在世 界农业发展史上起着重要的作用。几个世纪以来，化学农药在农林生产中防治病虫害起到 非常重要的作用。但由于大量使用，已造成环境污染严重，病虫害抗药性增强，形成恶性循 环，严重影响人类健康和生态平衡。生物防治是农林生产中的必然趋势。利用拮抗微生物 防治植物病害是其中一个主要内容。在研究开发的各种生防菌中，利用生防细菌来防治植 物病害成为国内外在生物防治中的一个热点。大量研究表明，生防细菌不仅在其生长发育 过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用，达到阻碍或杀死病原 菌的效果。大部分生防细菌都是从植物的根围、根际和叶围等处分离获得，对植物具有较好 的亲合性，接种后易在植物上定殖、存活，防治效果持久稳定。芽孢杆菌是一群好氧或兼性厌氧、产芽孢的革兰氏阳性菌。芽孢杆菌分布及其广 泛，极易分离培养，是土壤和植物体表、根际的重要微生物种群。所产生的芽孢具有耐热抗 逆的特点，极利于菌剂的生产、剂型的加工以及在环境中存活、定殖和繁殖。批量生产上工 艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前，对芽孢杆菌研 究较多的是枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌等，对坚强芽孢杆菌用于生物防治的研究国内外 参考文献较少。朱天辉等(林业大学，2007，43 (2) 120-123)等从苗圃土壤中分离纯化出 一株具有拮抗活性的坚强芽胞杆菌，专利(申请号=200710121274. 6)提供了一株防治草莓 白粉病的坚强芽胞杆菌菌株SAB-1，因此筛选对病原菌具有抑制作用的坚强芽胞杆菌是防 止植物病害的最有效方法之一。目前为止，防止其他病虫害如黄瓜白粉病、核桃炭疽病、黄 瓜灰霉病、小麦纹枯病、苹果轮纹病、烟草赤星病、玉米小斑病、冬枣黑斑病、棉花枯萎病、棉 花红腐病、小麦赤霉病等未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的坚强芽孢杆菌菌株，它可以用作生物农药，防治植 物多种病害。本发明所提供的菌株为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02是从山东省林业 科学研究院实验苗圃土壤中采用土壤稀释分离法分离获得到的，已于2009年06月19日 保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯 路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 3129。其具有以下微生物学特性菌体 杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，白色，平展，表面粗糙， 中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。本发明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf_02 CGMCC No. 3129的培养方法或繁 殖方法(1)普通培养采用NA培养基保存。实验室液体培养采用NYBD液体培养基。NYBD配方牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。(2)大量发酵培 养配方(质量百分含量)豆粉1. 8 %，玉米粉1.6%，淀粉和碳酸钙各0. 44 %，鱼粉0. 47 %， 硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH 7.3。采用此培养基发酵培养，菌落可达 40 亿 /g。该微生物制剂可以作为生物农药，防治多种植物病害。利用坚强芽孢杆菌防治黄 瓜、土豆根线虫，可直接杀死线虫细胞，具有极好的防治效果。利用绿粘帚霉与坚强芽孢杆 菌，预先接种生防菌协同控制松赤枯病取得一定效果。坚强芽孢杆菌防治黄瓜白粉病，防治 效果可达79.02%。坚强芽孢杆菌可以防治核桃炭疽病、黄瓜灰霉病、小麦纹枯病、苹果轮纹 病、烟草赤星病、玉米小斑病、冬枣黑斑病、棉花枯萎病、棉花红腐病、小麦赤霉病等多种病 害。室内对峙试验表明其对多种病菌影响如下表所示。表1 坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. No. 3129 对多种病菌的影 响
小麦赤霉病菌10.33 ±1.86cd65.92± 2.93d玉米小斑病菌12.33 土2.27ab76.97士 1.49a
苹果轮纹病菌10.50 ±1.66cd78.64± 2.04 a核桃炭疽病菌12.75 ±1.13a78.34±4.67a
小麦纹枯病菌8.04±1.77e65.37 ±1.69d黄瓜灰霉病菌11.21 ±1.87bc73.60士7.89bc
烟草赤星病菌12.33 ±1.32ab66.75 ±2.90d棉花枯蒌病菌9.33 士 1.28de76.67±2.50ab
棉花红腐病菌11.46±1.49abc52.30 ±5.09e冬枣黑斑病菌11.25±1.28bc73.30 ±1.68c坚强芽孢杆菌也是昆虫病原细菌。利用坚强芽孢杆菌可以防止黄条跳甲，4亿/mL 浓度48h死亡率可达100%。坚强芽孢杆菌可以侵染臭椿皮蛾和乔蝽巢蛾，利用坚强芽孢 杆菌处理叶片，幼虫18-24h停止取食，72h死亡率可达80-100%。幼虫死亡后变黑，虫体变 软，轻微触动可流出黑色液体。
图 1 为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. No. 3129 放大 10K 倍的
光学显微镜照片。
具体实施例方式实施例1 1、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 的分离与纯化本发明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129从山东省林业科 学研究院实验苗圃土壤采用土壤稀释分离法分离获得，分离方法为(1) 土样采集从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗 筛，取25g作分离用；
(2)培养基平板制备将NA培养基(营养琼脂培养基)和PDA(马铃薯葡萄糖琼 脂培养基)培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；所述NA培养基配 方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂14g，蒸馏水IOOOmL, ρΗ7· 3。所述PDA培养基配 方为马铃薯(去皮切块)200g，葡萄糖17g，琼脂12-14g，蒸馏水lOOOmL。(3)称取Ig 土样于250mL灭菌三角瓶中，加IOOmL无菌水，振荡，制成10_2 土壤悬 浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10_7 ；(4)取上述土壤悬浮液lmL，加到培养基NA或PDA平板上平板上，用弯玻棒涂勻。 置于培养箱26°C恒温培养5-7d。2、菌株鉴定(1)微生物学特性菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养 菌落圆形，白色，平展，表面粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜 色棕黄色，浑浊，有沉淀。(2)生化特性如表2所示。表2 坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 的生化特性 注“ + ”表示生长或反应阳性；“_”表示不生长或反应阴性实施例2 坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 的发酵NA培养基配方(市售)蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂14g，蒸馏水lOOOmL，ρΗ7· 3。
NB配方蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，ρΗ7· 3 ；NYBD配方牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。大量发酵培养配方(质量百分含量)豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉0.44%，碳 酸钙0. 44%，鱼粉0. 47 %，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH 7. 3。1、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 菌种活化将斜面上保存的菌种接种到NA试管斜面上面，于28°C培养24h。2、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 种子液的制备从斜面上挑三环菌接种到装有NB培养液的三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振 荡培养，280C，200r/min培养8h即可获得种子液。3、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 发酵液的制备以培养液初始pH7. 2，初始接种量2%，装液量50mL/500mL，将种子液接入到装有 NYBD发酵培养液的500mL三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28°C，200r/min培 养 48h。4、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 发酵培养将摇床发酵的菌液接种到装有IOOmL培养基的200mL种子发酵罐，初始pH7. 2，温 度32°C，通风体积比1 0.8，从菌种接种后12h菌体生长处于指数生长中期，转入2000L 的发酵罐，以70%的罐装量，pH7.3，温度为28-34°C，前期通风体积比为1 0.8，后期通风 体积比为1 1发酵。采用此培养基发酵培养，菌落可达40亿/g。实施例3 坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129发酵液的应用为了明确坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129发酵液对黄瓜 灰霉病的防治增产效果，为其推广应用提供依据。我们于2008年1-2月份在临邑试验基地 进行此试验，现将试验结果报告如下1供试材料及方法1.1供试药剂按本发明发酵方法生产的坚强芽孢杆菌(Baci 1 Ius f irmus) Bf-02 CGMCC No. 3129发酵液；40%咪霉胺可湿性粉剂(山东寿光双星农药有限公司生产，市售)。1. 2供试作物与防治对象供试作物为黄瓜，品种为长春密刺；防治对象灰霉病1. 3试验地情况试验地设在山东省临邑县临南镇大聂村，该村大棚黄瓜灰霉病近几年发生严重， 且防治困难，试验在620平方米(0.93亩)黄瓜大棚内，土质为轻壤土，有机质含量为 1. 07%, pH值为6. 9，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时黄瓜灰霉病处于发病 初期。1. 4试验设计及安排本试验设坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129发酵液10倍， 40%咪霉胺可湿性粉剂可湿性粉剂600倍液及不施药清水作对照共3个处理，重复4次，共 12个小区，各小区随机排列，小区面积为20平方米。于2008年1月29日、2月6日和13 日各喷药一次，将植株叶片上下喷洒均勻、周到，喷药时用塑料布遮挡，亩用药液60公斤， 喷药器械为工农-16型喷雾器。
1. 5试验调查及计算方法1.5. 1气象条件第1次施药(1月29日)当日少云，风力3级，最高气温为13°C，最低气温为4°C， 相对湿度为75%。第2次施药(2月6日)，当日多云，风力4级，最高气温为irC，最低气 温为2°C，相对湿度为70% ；第3次施药(2月13日)当日晴，风力3级，最高气温为9°C， 最低气温为1°C，相对湿度为80%。因塑料大棚环境条件相对稳定，所以该气候对药效没有影响。1. 5. 2药效及安全性调查药效调查第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用4点取样法，每点查2株，调查全部叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。安全性调查于第一次施药后7d和14d观察黄瓜的安全性，如有药害发生，详细描 述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。分级方法(以叶片为单位)0级无病班1级病班面积占整个叶面积的5%以下；3级病班面积占整个叶面积的6% -10% ；5级病班面积占整个叶面积的11 % -25% ；7级病班面积占整个叶面积的26% -30% ；9级病班面积占整个叶面积的50以上；1.5. 3调查时间和次数施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后IOd调查防治结果。1.5.4药效计算方法药效按式⑴、⑵计算
病情指数(各级病叶数χ相对级数值\100⑴ ‘Λ调查总叶数χ9 式中=CKci—空白对照区施药前病情指数；CK1——空白对照区施药后病情指数；PT0——药剂处理后施药前病情指数；PT1——药剂处理后施药后病情指数。1. 5. 5对作物的直接影响观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对作物的其他 有益影响(例如促进成熟、刺激生长等)。用下列方式记录药害(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率
(1)按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以_、+、++、+++、++++表示。药害分级方法-无药害；+ 轻度药害，不影响作物生长；++ 中度药害，可复原，不会造成作物减产；+++ 中度药害，影响作物正常生长，对作产量和质量造成一定程度的损失；++++ 严重药害，作物生长受阻，产量和质量损失严重。(2)将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述作物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)2 结果2. 1供试药剂对棉花黄萎病的防治效果表3结果显示，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129发酵液及 及40%咪霉胺可湿性粉剂对黄瓜灰霉病有较好的防治效果，一次用药7d后防治效果均达 到60%以上，其中坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129发酵液防治效果最好。从黄瓜灰霉病田间试验的病情指数来看(表3)，一次用药7d后，坚强芽孢杆菌 (Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129 防治效果为 77. 14%，明显高于 40%咪霉胺可湿 性粉剂的防治效果。表3各处理防治黄 瓜灰霉病试验效果调查原始数据 临邑13/2，2008 2. 2黄瓜安全性调查经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，黄瓜生 长正常，无药害产生，说明坚强芽孢杆菌Bacillus firmus Bf-02 CGMCC No. 3129发酵液在 供试浓度对黄瓜安全。2. 3坚强芽孢杆菌发酵液对黄瓜增产效果表4对黄瓜增产试验结果分析表 注小区面积33. 4m2 ；处理1为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCCNo. 3129发酵液，处理2为对照组药剂(40%咪霉胺可湿性粉剂)。将表2资料进行Duncan，s方差分析处理 样本数 均值标准差处理1 3252. 41002. 2987处理2 3194. 24000. 9585方差分析表变异来源 平方和自由度 均方F值显著水平
处理间5075.6230 15075.6230 1636.615 0.0000处理内12.40524 3.1013总变异5088.0282 5Duncan多重比较(下三角为均值差，上三角为显著水平)No. 均值121 252. 410000.00002 194. 24000 58.1700字母标记表示结果处理 均值5%显著水平极显著水平处理1 252.41000 aA处理2 194. 24000 b B由以上结果可知，在黄瓜上喷灌坚强芽孢杆菌发酵液(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCCNo. 3129，处理区比对照区每亩增产黄瓜1292. 673kg，增产率为29. 95% ；效果十分 明显。在P < 0. 01水平上具有显著性差异，说明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCCNo. 3129发酵液的防病增产作用非常明显。3 小结3. 1从病情指数和防治效果来看，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No. 3129对黄瓜灰霉病具有较好的防治效果，在一次施药后7d可达70%以上，明显好于对 照药剂，差异显著。3. 2 从黄瓜增产 效果看，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf_02 CGMCC No. 3129 对黄瓜具有明显的促生增产效果，一次施药后增产率为29. 95%。
权利要求
坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02CGMCC No.3129。
2.权利要求1所述的坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129的分离与纯化方法(1)土样采集从山东省林业科学研究院实验苗圃土壤表层到15cm处取样200g，混合 过粗筛，取25g作分离用；(2)培养基平板制备将NA培养基和PDA培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制 成NA和PDA平板，所述NA培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂14g，蒸馏水 IOOOmL, pH7. 3 ；所述PDA培养基配方为去皮切块的马铃薯200g，葡萄糖17g，琼脂12_14g， 蒸馏水IOOOmL ；(3)称取Ig土样于250ml灭菌三角瓶中，加IOOmL无菌水，振荡，制成10_2 土壤悬浮液， 静置5min，按10倍梯度稀释到10_7 ；(4)取上述稀释后的土壤悬浮液lmL，加到培养基NA或PDA平板上，用弯玻棒涂勻，置 于培养箱26°C恒温，培养5-7天。
3.权利要求1所述的坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129的发酵方法1)坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-02CGMCC No. 3129菌种活化将斜面上保存的 菌种接种到NA试管斜面上面，于28°C培养24h，所述NA培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏 3g，NaCl 5g，琼脂 14g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 3 ；2)坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129种子液的制备从斜面上挑 三环菌接种到装有NB培养液的三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28°C，200r/ min培养8h即可获得种子液，所述的NB培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g， 蒸馏水 lOOOmL，pH7. 3 ；3)坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129发酵液的制备以培养液 初始pH7. 2，初始接种量2%，装液量50mL/500mL，将种子液接入到装有NYBD发酵培养液的 500mL三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28 V，200r/min培养48h，所述的NYBD 培养基配方为牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水lOOOmL，pH 7. 3 ；4)坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129发酵培养将摇床发酵的 菌液接种到装有IOOmL培养基的200mL种子发酵罐，初始pH7. 2，温度32 V，通风体积比 1 0.8，从菌种接种后12h菌体生长处于指数生长中期，转入2000L的发酵罐，以70%的 罐装量，PH7.3，温度为28-34°C，前期通风体积比为1 0. 8，后期通风体积比为1 1发 酵，所述大量发酵培养配方为豆粉1. 8 %，玉米粉1. 6 %，淀粉0. 44 %，碳酸钙0. 44 %，鱼粉 0.47%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH 7. 3，所述的百分数为重量百分 数。
4.坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129在防治作物的核桃炭疽病、 黄瓜灰霉病、小麦纹枯病、苹果轮纹病、烟草赤星病、玉米小斑病、冬枣黑斑病、棉花枯萎病、 棉花红腐病和小麦赤霉病方面的应用。
5.如权利要求4所述的坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129在防治 黄瓜灰霉病的防治方面的应用。
6.坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129在黄瓜促生增产方面的应用。
7.坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-02CGMCC No. 3129在防治黄瓜、土豆根线虫方 面的应用。
8.坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-O2CGMCC No. 3129在防止黄条跳甲方面的应用。
9.坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)Bf-02CGMCC No. 3129在杀灭臭椿皮蛾和乔蝽巢蛾 方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一株坚强芽孢杆菌。该坚强芽孢杆菌菌株为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCC No.3129。它作为生物农药，可以防治核桃炭疽病、黄瓜灰霉病、小麦纹枯病、苹果轮纹病、烟草赤星病、玉米小斑病、冬枣黑斑病、棉花枯萎病、棉花红腐病、小麦赤霉病等多种植物病害。本发明通过试验表明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02 CGMCCNo.3129发酵液防治蔬菜尤其是黄瓜灰霉病效果显著，且蔬菜生长健壮，无药害产生，对黄瓜具有明显的促生增产效果，一次施药后增产率为29.95％。
文档编号A01P1/00GK101845409SQ20091025646
公开日2010年9月29日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘幸红, 张淑静, 牛赡光, 王清海 申请人:山东省林业科学研究院