专利名称：快速、安全地进行pcr扩增的技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及提取DNA以用于PCR扩增反应和其他分子生物学方法的新的广谱的快速制备方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)提供了一种在需要或不需要提前培养生物体的情况下，增加目的序列拷贝数(扩增信号)的方法，因而，该方法允许增加检测在来自混合群体的具有DNA的样品中以少量存在的DNA序列的灵敏度(0u，C. Y.等人，Science 239 :292-295 ； Saiki, R. K.等人 Science 239 :487-494 ；Saiki, R. K.等人 Science 230 :1350-1354 ； Scharf，S. J.等人Science 233 :1076-1078)。该方法包括使DNA解链，并使短寡聚体引物退火至在目的序列侧面的区域。在游离的脱氧核苷酸存在的情况下，向混合物中加入DNA 聚合酶，并使DNA从引物延伸穿过目的区域。新的双链体又一次被解链，并重复这一过程。 这导致特定靶的指数累积，约为2n，其中η是解链和引物延伸的循环数。基因组单拷贝序列能够以高特异性扩增大于1000万倍。该方法通过使用从水生栖热菌(Thermus aquaticus) (Taq)中分离出来的热稳定聚合酶而得到改进，其避免了在每次解链循环后添加新的聚合酶的需要，并且已显示出具有高特异性。在微生物学领域和医学实践领域必需的一个方面是在属、种或血清型水平上确定地鉴定出微生物的能力。正确的鉴定不仅在实验室中是一个必要的手段，而且它也在食品加工过程、农产品的生产过程中和监测环境介质如地下水时对控制微生物的污染发挥显著作用。应用于微生物污染的规定的严格性增加已导致必需专用于污染监控的工业资源相应地增加。由于具有鉴定微生物和检测病毒DNA的能力，PCR在检测和诊断疾病中的作用越来越重要。例如，Weiburg等(EP517361)公开了一种包括PCR扩增大肠杆菌(E. coli)的 DNA用于检测和鉴定病原微生物的方法。细菌和病毒DNA的检测在许多疾病的治疗中都有很大的帮助。因此，在现在的医学领域，对于医生或其他医学人员重要的是快速、准确地检测与患者有关的生物液体或其他液体中的病原微生物。在进行PCR之前，首先必需对样品中的DNA(或RNA)进行纯化。纯化DNA需要进行提取步骤，其一般涉及破坏待分析样品的细胞膜，使细胞内的蛋白变性以及将DNA从变性的蛋白质和其他细胞组分中分离出来。对于临床医生和法医科学家可用的DNA提取技术既耗时，又费力，通常需要进行多个步骤并且使用危险试剂。传统的DNA提取技术包括密度梯度离心，有机溶剂沉淀和/或盐沉淀。除了上述问题，这些技术还会增加样品之间交叉污染的风险。与DNA提取和纯化相关的问题已引起了设计为提高效率和安全性的新方法。固相提取方法，如美国专利5234809和美国专利7238530所公开的那些方法，已经被用于纯化包括DNA和RNA在内的核酸分子。该方法包括裂解细胞，将释放的DNA结合到固相支持物上， 洗去杂质以及提取纯化的DNA。优选的裂解剂是离液剂硫氰酸胍和盐酸胍。固相支持物优选硅颗粒。尽管该方法旨在简化样品的处理过程，但其仍然是微生物特异性的并且仍然需要多个实验步骤。此外，DNA的提取方法需要使用高浓度的有毒试剂。也设计了液相方法用于简化DNA的提取方法。一种此类方法需要使用螯合树脂 Chelex 100，一种含有成对的亚氨基二乙酸盐的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。这种树脂能够清除金属污染物(如镁)，而这些金属污染物催化核酸的降解。此外，Chelex. 100能够破坏细胞膜并使DNA变性。在实践中，将样品溶于蛋白酶K存在下的水中并于55°C孵育溶液约1个小时。接着将混合物加热至100°C的温度另外进行15分钟。然后将混合物漩涡振荡并且离心。变性后的蛋白和金属离子沉淀到管底部。来自上清液的等分物(aliquot)可用于进行PCR。需要注意的是这种方法需要多个操作过程，复杂的人为干预，并且要加热到 100°C，这些增加了处理时间和处理过程的危险，尤其是当使用危险的致病性材料操作时。 另外，并不是所有类型的样品都适用于该方法操作。还需要注意的是，市场上的大多数试剂盒所提供的是制备非致病性样品的有限的装置(means)，这迫使分析者在具有生物危险的条件下进行PCR实验。这带来了重大的安全问题，而这些问题在本领域中并没有得到充分的解决。这样，研究者可能需要在生物安全3 级或4级(BSL-3或BSL-4)的实验室来进行实验，这进一步增加了处理时间。因此，需要发展简化的、更加快捷和低危险性的方法来分析生物样品。尤其是需要发展更快、更安全和更经济的方法来分析致病性样品。方法必须能够快速、高效地使病原体失活，同时保持待扩增和分析的核酸(如DNA)的完整性。此外，简化的方法允许在偏远的小型诊所和医务中心使用并不昂贵的PCR设备，这将有助于医务工作者获得快速、确定的诊断结果，以便于治疗他们的患者。发明概述本发明提供了非常快速、简便的(一步)裂解液体样品(如血液、唾液、尿液或其他)中细胞的方法，该方法的目的在于从样品中发现的病原体中提取核酸(如DNA或者 RNA)，同时为实验室工作者提供了不需要使用复杂设备如加热设备或超声设备就能进行处理的无生物危险的样品。所述DNA能作为PCR或者其他微生物方法的底物，这引起病原体的快速扩增和鉴定，同时破坏可能的(in question)病原体的活性。在本发明的一个方面中，使用碘化树脂作为活性剂来裂解含有病原体(如病毒或细菌)的液体样品中的细胞，并且破坏病原体的致病能力。接着用PCR方法对来自裂解细胞的核酸进行扩增和鉴定。碘化树脂不会对DNA的完整性产生负面影响，因此，PCR的性能和灵敏度都是最优化的。本发明的一个方面是分析生物样品的方法，其包括以下步骤提供含有病原体的液体样品，将该液体样品与碘化树脂相接触，将碘化树脂从液体中分离出来和通过分析技术确定病原体身份(identity)。本发明的另一个方面是分析生物样品的诊断试剂盒，其包括以下步骤提供含有病原体的液体样品，将该液体样品与碘化树脂相接触，将碘化树脂从液体中分离出来和通过分析技术确定病原体身份。本发明的另一个方面是包含碘化树脂的前-PCR诊断试剂盒，所述试剂盒允许省去加热和/或冷却和/或超声步骤和设备。发明详述本发明提供了分离病原样品的DNA的快速、安全的方法，所述DNA用于PCR或者其他的微生物方法。该方法包括使用需求的(demand)消毒剂碘化树脂作为活性剂来裂解细菌的细胞膜或病毒的保护性外壳，由此从病原体中将核酸物质移出。碘化树脂破坏病原体的毒性效应，同时保持所述病原体的DNA。令人惊奇的，已发现新的技术显著地减少了实验步骤的数目、时间和用PCR分析生物样品所需要的劳动力，同时破坏可能的微生物的致病性。碘化树脂已被建议用作需求的消毒剂，命名为消毒剂，其中碘基于按需作用 (demand-action)被几乎完全释放。碘化树脂(“^^0#11”树脂)，如美国专利5639453 (‘452 专利)所公开的那种，可用于增强裂解作用和破坏微生物的致病性而不对PCR过程产生负面影响。‘452专利的内容被全部引入本文作为参考。Triosyn样品(珠子，片段，粉末)全部都包含三碘化物分子，其是用于破坏诸如病毒、细菌和真菌等的微生物细胞膜的抗微生物组合物。除了存在的三碘化物，由于具有不规则的形状和锋利的边缘，片段和粉末具有另一种抗微生物活性，这使得Triosyn片段或颗粒能机械地插进细菌的细胞膜或者病毒的保护性衣壳。用于本发明的三种这类Triosyn树脂粉末是指Triosyn T-50粉末、Triosyn T-45 粉末、Triosyn T-40粉末。这些数字代表碘相对于树脂的大致重量百分比。具有其他的碘重量百分比的粉末也可以用于本发明。碘化树脂粉末中碘的不同百分比赋予粉末不同的性质，尤其是在裂解和杀生物活性的不同水平。用于方法的具体树脂是基于所需要的应用。在被处理用于PCR的样品中的Triosyn树脂珠子的用量为每500 μ 1细菌悬浮液约0. 0025g 到约0. 5g的范围。在本发明的一个方面，提供了快速、安全的从包含病原体的液体样品中纯化DNA 或RNA的方法。所述样品可以是例如血液、唾液或者尿液。将含有病原体的样品加入到无菌的微量离心管中。接着再加入Triosyn珠子或片段，旋涡振荡样品。旋涡时间在1_5分钟之间，取决于样品和碘化树脂活性剂的性质。然后将样品离心，使碘化树脂转移到管底部。 离心可进行约1-10分钟，优选约5分钟。离心之后，大部分DNA和RNA在上清液里而不是管底部。同样地，通常使DNA降解的杂质转移到管底部。这些杂质可能包括被碘化树脂变性的蛋白质和与碘化树脂进行交换的金属离子。因此，上清液中的DNA或RNA包含有活性的(viable)且可作为底物用于包括PCR的进一步应用的DNA或者RNA。碘化树脂不会破坏样品的DNA或RNA。在可选的实施方案中，在旋涡振荡之前，可以向包含碘化树脂的样品中加入蛋白酶K。蛋白酶K将辅助碘化树脂将样品中的蛋白变性。当用碘化树脂使样品无害之后，可以不需要进一步的制备和处理，用PCR分析安全地来检测样品，以便于确定样品中包含何种病毒或细菌。PCR扩增是本领域中的标准方法。例如，PCR扩增步骤以在美国专利5234809,5928906和7238530中描述，其在此全部引入作为参考。重要的是，碘化树脂不会对PCR过程和酶具有负面影响。因此，使用本发明中的方法，医务人员能够快速、安全地确定存在于特定生物样品中病毒或细菌的特性。此外， 由于该方法的简便和低成本，该方法使得小型的医疗中心和偏远的地区都可以安置PCR设备，并使得医务人员能够快速地获得诊断结果。然而，现有的技术并不能实现这一点，因为其需要特殊和复杂的诊断试剂盒，这些试剂盒要求使用昂贵的加热或超声设备来能够实施该检测。
示例微生物以下是可使用本发明的方法检测的微生物的非限制性列表。 有尾噬菌体目(Caudovirales)〇肌尾噬菌体科(Myoviridae)-包括肠杆菌噬菌体！"4〇短尾噬菌体科(Podoviridae)〇长尾噬菌体科(Siphoviridae)-包括肠杆菌噬菌体λ 疱疫病毒目(Herpesviridae)〇水生动物疱疹病毒科(Alloherpesviridae)〇疱疹病毒科(Herpesviridae)-包括人疱疹病毒、水痘带状疹子病毒O Malacoherpesviridae 未指定的科〇囊泡病毒科(Ascoviridae)〇腺病毒科(Adenoviridae)〇非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)-包括非洲猪瘟病毒〇杆状病毒科(Baculoviridae)〇 Coccolithoviridae〇覆盖噬菌体科(Corticoviridae)〇微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)〇滴状病毒科(Guttaviridae)〇虹彩病毒科(Iridoviridae)〇脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)〇线形病毒科(Nimaviridae)〇乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)OMM DNA(Phycodnaviridae)〇芽生噬菌体科(Plasmaviridae)〇多瘤病毒科(Polyomaviridae)-包括猴病毒40、JC病毒〇痘病毒科(Poxviridae)-包括牛痘病毒，天花〇古噬菌体科(Rudiviridae)〇复层噬菌体科(Tectiviridae) 未指定的属〇 Mimivirus 未指定的噬菌体科〇丝状噬菌体科(Inoviridae)〇微小噬菌体科(Microviridae) 未指定的科〇联体病毒科(Geminiviridae)〇圆环病毒科(Circoviridae)〇纳米病毒科(Nanoviridae)〇细小病毒科(Parvoviridae)-包括细小病毒Β19
未指定的属〇指环病毒属(Anellovirus) 塔状突起的〇水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)模式种A型水生呼肠孤病毒〇质型多角体病毒属(Cypovirus):模式种1型质型多角体病毒(CPVl)〇斐济病毒属(Fijivirus):模式种Fiji病病毒〇虫源呼肠孤病毒属(Idnoreovirus)模式种1型虫源呼肠孤病毒〇真菌呼肠孤病毒属(Mycoreovirus)模式种1型真菌呼肠孤病毒〇正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)模式种哺乳动物正呼肠孤病毒〇水稻病毒属(Oryzavirus)模式种水稻齿矮病病毒 非塔状突起的〇科罗拉多蜱传染症病毒属(Coltivirus)模式种科罗拉多壁虱热病毒(CTFV)〇环状病毒属(Orbibirus)模式种蓝舌病毒〇植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)模式种矮稻小病毒〇轮状病毒属(Rotavirus)模式种A型轮状病毒一痢疾的常见病因〇东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus) 套式病毒目(Nidovirales)〇动脉炎病毒科(Arteriviridae)〇冠状病毒科(Coronaviridae)—包括冠状病毒，SARSO杆套病毒科(Roniviridae) 未指定〇星状病毒科(Astroviridae)〇双 RNA 病毒科(Barnaviridae)〇雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)〇杯状病毒科(Caliciviridae)—包括诺瓦克病毒〇长线形病毒科(Closteroviredae)〇豇豆花叶病毒科(Comoviredae)O二順反子病毒科(Dicistroviridae)〇黄病毒科(Flaviviridae)—包括黄热病毒、西尼罗河病毒、丙肝病毒、登革热病〇弯曲病毒科(Flexiviridae)〇光滑病毒科(Leviviridae)〇黄症病毒科(Luteoviridae)—包括大麦黄色侏儒病毒〇海洋 RNA 病毒科(Marnaviridae)〇裸露 RNA 病毒科(Narnaviridae)〇野田病毒科(Nodaviridae)〇小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)—包括脊髓灰质炎病毒，普通感冒病毒， 甲型肝炎病毒〇马铃薯Y病毒科(Potyviridae)
〇随伴病毒科(Sequiviridae)〇四病毒科(Tetraviridae)〇披膜病毒科(Togaviridae) —包括风疹病毒、罗斯河病毒、辛德毕斯病毒、基孔肯亚热病毒〇番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)〇芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae) 未指定的属〇甜菜坏死黄脉病毒属(Benyvirus)〇樱桃锉叶病毒属(Cheravirus)〇真菌传杆状病毒属(Furovirus)OE型肝炎病毒属Ofepevirus)—包括戊型肝炎病毒O^^^I^M (Hordeivirus)O悬钩子病毒属(Idaeovirus)〇欧尔密病毒属(Ourmiavirus)〇花生丛簇病毒属(Pecluvirus)〇马铃薯病毒属(Pomovirus)〇温州蜜柑萎缩病毒属(Mdwavirus)〇南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)〇烟草花叶病毒属(Tobamovirus)—包括烟草花叶病毒〇烟草脆裂病毒属(Tobravirus)〇伞形植物病毒属(Umbravirus)參单股反链病毒目(Mononegavirales)〇玻那病毒科(Bornaviridae)—博纳病病毒〇丝状病毒科(Filoviridae)—包括埃博拉病毒，马尔堡病毒〇副黏液病毒科(Paramyxoviridae)—包括麻疹病毒，腮腺炎病毒，尼帕病毒，亨德拉病毒〇弹状病毒科(Iihabdoviridae)—包括狂犬病病毒 未指定的〇沙粒病毒科(Arenaviridae) —包括拉沙病毒〇布尼亚病毒科(Bunyaviridae)—包括汉滩病病毒〇正粘病毒科(Orthomyxoviridae) —包括流感病毒〇未指定的属■ δ 病毒属(Deltavirus)■蛇状病毒属(Ophiovirus)■纤细病毒属(Tenuivirus)■巨脉病毒属(Varicosavirus) 转座病毒科(Metaviridae)參假病毒科(Pseudoviridae) 逆转录病毒科(Retroviridae)—逆转录病毒，如HIV
嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)—如乙型肝炎病毒 花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)—如花椰菜花叶病毒下述门的细菌Slff^n (Acidobacteria)Μ^ΜΠ (Actinobacteria)产水菌门(Aquificae)(Bacteroidetes)/ ^ Π (Verrucomicrobia)绿弯菌门(Chloroflexi)产金菌门(Chrysiogenetes)Μ ^Π (Cyanobacteria)脱铁杆菌门(Deferribacteres)异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)网团菌门(Dictyoglomi)纤维杆菌门(Fibrobacteres)厚壁菌门(Firmicutes)梭杆菌门(Fusobacteria)芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)硝化螺旋菌门(Nitrospirae)浮霉菌门(Planctomycetes)变形菌门(Proteobacteria)螺旋体门 Gpirochaetes)联合菌门(Synergistetes)软壁菌门(Tenericutes)热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)热袍菌门(Thermotogae)
实施例下述部分描述本发明的示例性实施方式。对于本领域技术人员显而易见的是本文提供的所描述的本发明的实施方式只为说明性的且不是限制性的，仅通过举例的方式提供。除另有明确说明，该说明书中公开的所有特征可被具有相同或者类似目的的可替换的特征所替换。因此，其修饰的多种其他实施方式被认为落入如本文所定义的本发明的范围及其等价物中。碘化树脂对病原体的活性实验数据以下实施例显示需求的消毒剂碘化树脂除去微生物病原性的能力。一般步骤1)将指示量的Triosyn加入到事先标记的管中。2)加入IOmL万古霉素抗性的肠球菌(enterococci) ( “VRE”)悬浮液(或甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(mrsa)、疱疹病毒、肝炎病毒、沙眼衣原体)。3)漩涡振荡(设置5)指示的接触时间。
4)溶解于PBS中并立即涂板(不要中和)。实施例1将1Triosyn T40珠子(0. 025g)加入到事先标记的管中，向管中加入IOmL的VRE悬浮液(一个菌落用300-500 μ 1稀释)，接着漩涡振荡样品。样品于0、2、5、10、15和30分钟的时间点对活性VRE的存在进行分析。发现在2分钟和5分钟的时间点，活性VRE减少，到 10分钟的时间点，管中基本上没有活性VRE。在15分钟和30分钟的时间点，没有活性VRE 的存在。该实验过程中设置对照，该对照为在没有Triosyn Τ40珠子存在下漩涡振荡VRE 悬浮液，其结果是活性VRE的量没有减少。实施例2将1Triosyn Τ40珠子(0. 025g)加入到事先标记的管中，向管中加入IOmL的VRE悬浮液(一个菌落用300-500 μ 1稀释)，接着漩涡振荡样品。样品于0、2、5、10、15和30分钟的时间点对活性VRE的存在进行分析。发现在0分钟的时间点，活性VRE减少，到2分钟的时间点，管中基本上没有活性VRE。在5、10、15和30分钟的时间点，没有活性VRE的存在。 该实验过程中设置对照，该对照为在没有Triosyn Τ50珠子存在下漩涡振荡VRE悬浮液，其结果是活性VRE的量没有减少。实施例3将Triosyn Τ40珠子(0. 025g)加入到事先标记的管中，向管中加入IOmL的VRE 悬浮液(一个菌落用300-500 μ 1稀释)，接着漩涡振荡样品。样品于0、2、5、10、15和30分钟的时间点对活性VRE的存在进行分析。发现在0和2分钟的时间点，活性VRE减少，到5 分钟的时间点，管中基本上没有活性VRE。在10、15和30分钟的时间点，没有活性VRE的存在。该实验过程中设置对照，该对照为在没有Triosyn Τ45珠子存在下漩涡振荡VRE悬浮液，其结果是活性VRE的量没有减少。实施例4将1Triosyn Τ40珠子(0. 025g)加入到事先标记的管中，向管中加入IOmL的VRE悬浮液(一个菌落用300-500 μ 1稀释)，接着漩涡振荡样品。样品于0、2、5、10、15和30分钟的时间点对活性VRE的存在进行分析。发现在0分钟的时间点，管中基本上没有活性VRE， 片段不需要涡旋振荡。在2、5、10、15和30分钟的时间点，没有活性VRE的存在。该实验过程中设置对照，该对照为在没有Triosyn Τ50珠子存在下漩涡振荡VRE悬浮液，其结果是活性VRE的量没有减少。实施例5将Purolite Α-605碘化树脂珠子(0. 025g)加入到事先标记的管中，向管中加入 IOmL的VRE悬浮液(一个菌落用300-500 μ 1稀释)，接着漩涡振荡样品。样品于0、2、5、 10,15和30分钟的时间点对活性VRE的存在进行分析。发现在0分钟的时间点，管中基本上没有活性VRE，片段不需要涡旋振荡。在2、5、10、15和30分钟的时间点，没有活性VRE的存在。该实验过程中设置对照，该对照为在没有Purolite Α-605珠子存在下漩涡振荡VRE 悬浮液，其结果是活性VRE的量没有减少。实施例6 (对照实施例)将Triosyn 402-C1树脂珠子(0. 025g)加入到事先标记的管中，向管中加入IOmL 的VRE悬浮液(一个菌落用300-500 μ 1稀释)，接着漩涡振荡样品。样品于0、2、5、10、15和30分钟的时间点对活性VRE的存在进行分析。申发现在任何一个时间点Triosyn 402-C1 珠子都没有清除活性VRE。实施例1-5中的结果表明碘化树脂能够完全破坏病原体的感染宿主的能力。不含碘的对照树脂珠子(实施例6)不能使微生物失活。基于这些发现，我们检测了含有碘化树脂的样品是否可以用作DNA扩增的底物。进行PCR实验的实验步骤以下结果显示本发明的方法可用于有效地对病原体的DNA进行PCR。如上文所讨论的，由于病原体的活力(virility)被有效地破坏，因此该方法使得研究者们能够在没有污染，或者不需要在严格的生物风险条件下工作来实施PCR实验。实施例7Fortuitim mac farland 3 在无菌的微型离心管中，加入500μ 1以1 500的分枝杆菌!^ortuitim mac farland 3悬浮液的稀释液。 加入4剂量(约0. 025g)T50 Triosyn碘化树脂珠子。 以最高速漩涡振荡2分钟。 离心5分钟，在分歧杆菌特异性的PCR反应混合物中检测5 μ 1上清液。对PCR的结果进行定量显示了用该步骤制备的DNA具有高质量，可以成功地被扩增和分析。因此，碘化树脂没有对DNA带来不利的影响。我们怀疑PCR扩增的高质量部分涉及PCR溶液中不存在存活的微生物，这些微生物会对PCR过程带来负面的影响。我们通过将Loewenstein Jensen管与悬浮液一起孵育， 在72小时后检验是否存在细菌生长，来检测Triosyn T50珠子的微生物效力。用碘化树脂珠子制备的样品在72小时后并没有显示出有细菌生长。没有碘化树脂珠子的对照样品在 72小时后显示出显著的细菌生长(菌落数> 200)。实施例8万古霉素抗性的肠球菌VRE 与分枝杆菌使用同样的方法4剂量T50 Triosyn碘化树脂珠子，漩涡振荡2分钟，用上清液进行PCR。 该实验的结果显示很好的PCR数据。实施例9衣原体 尿液样品，初始离心浓缩液加入200 μ 1水+4剂量Τ50 Triosyn碘化树脂珠子；漩涡振荡2分钟，用PCR分析上清液。 该实验的结果显示了很好的PCR数据。实施例10疱疹病毒(HSV)·从运输液中回收样品。 加入4剂量Τ50 Triosyn碘化树脂珠子，漩涡振荡2分钟，用上清液进行PCR。 该实验的结果显示了很好的PCR数据。实施例7-10中所示的结果表明碘化树脂能够完全破坏病原体的感染宿主的能力。此外，该方法允许使用者能够对样品进行高质量的PCR扩增，而不受病原体可能的感染。使用Amberlite树脂(非碘化树脂)的对照实验不能允许任何PCR扩增。因此，碘化树脂没有破坏微生物DNA的完整性。此外，实验可以在不使用消毒剂、化学添加剂、过滤冷却、超声和加热的情况下进行，因此大大加速了进程。PCR步骤的进行时间相应地也显著减少。
权利要求
1.一种分析生物样品的方法，其包括以下步骤(a)提供含有病原体的液体样品，(b)将所述液体样品与碘化树脂接触，(c)将所述碘化树脂从所述液体中分离出来，和(d)通过分析技术来确定病原体的身份。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述碘化树脂是珠子或者片段。
3.如权利要求1所述的方法，其中样品的接触用旋涡振荡设备来增强。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述液体部分的分离使用离心来进行。
5.如权利要求所述的方法，其中所述分析技术是PCR。
6.一种分析生物样品的方法，其包括以下步骤(a)提供含有病原体的液体样品，(b)将所述液体样品与碘化树脂相接触，(c)离心包含所述碘化树脂的所述液体样品，(d)将所述液体样品的一部分移去，(e)将所述液体样品的该部分加入对病原体特异性的PCR溶液，和(f)对PCR方法的结果进行定量。
7.如权利要求7所述的方法，其中所述病原体是细菌或者病毒。
8.如权利要求7所述的方法，其中样品的接触用旋涡振荡设备来起始。
9.一种实施如权利要求1所述方法的检测试剂盒，其包含扩增核酸的组分。
10.一种分析生物样品中病原体的试剂盒，其包括样品支持物中的碘化树脂，所述支持物包含至少能够加入所述生物样品的足够空间。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其进一步包括扩增核酸的组分。
12.—种前-PCR诊断试剂盒，其包含碘化树脂，所述试剂盒允许去除加热和/或冷却和 /或超声步骤和设备。
13.—种生物分子DNA/RNA的鉴定试剂盒，其包含碘化树脂，在无加热和/或冷却和/ 或超声设备的情况下允许PCR设备行使其功能。
全文摘要
本发明涉及从生物样品中快速、安全的鉴定病原体的方法。可以使用碘化树脂破坏病原体，同时将病原体DNA保留在可分析的状态。DNA随后可以用作PCR分析的底物。这些碘化树脂的使用以比现有技术方法明显加快的方式工作，并允许科学家在生物安全3级(BSL-3)条件下工作的时间最少。
文档编号A01N59/12GK102333883SQ200980152145
公开日2012年1月25日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者皮埃尔·J·梅西尔, 马克·托德杰曼 申请人:安全生活/特莱奥辛公司