使用杆菌菌株制备发酵大豆粉的方法

专利名称：使用杆菌菌株制备发酵大豆粉的方法
技术领域：
本发明涉及为了改善或改进作为植物蛋白质来源的脱脂大豆粉的质量，生产发 酵大豆粉的价廉并有效的方法，以及用相同的方法生产的发酵大豆粉。
背景技术：
由于对人致命的风牛病被证明是由牛饲料中的动物蛋白质成分引起的，就有一 种用植物蛋白质替代饲料中的动物蛋白质的渐增的全世界趋势。
脱脂大豆粉(在下文，被称作“大豆粉”)作为动物蛋白质诸如鱼粉、肉骨粉或 血浆的替代物，是饲料市场中使用的最常见的植物蛋白质来源。在韩国，被用作植物蛋 白质来源的大豆粉占全部粗粉供应的60%，达到每年2百万吨(韩国饲料成分协会(Korea Feed Ingredients Association), 2004)。
大豆粉通常是由9.5%的水、49.4%的粗蛋白质、22.1 %转化糖和27.2%可溶性 氮组成。一般而言，与动物蛋白质相比，植物蛋白质具有低的蛋白质含量，家畜需要的 必需氨基酸组成和一些维生素、矿物质和UGF(未知的生长因子)的含量也低。
而且，大豆粉含有许多种抗营养因子(ANFs)，当被用作饲料时，这些抗营养因 子可能有问题地削弱消化速度。其中，胰蛋白酶抑制剂(在下文，被称作“Ti”)是代 表性的ANF，在陆生动物中，已知饮食TI干扰胰蛋白质酶和糜蛋白质酶的固有功能，导 致大豆中存在的总蛋白质的利用率下降达大约6%。特别地，由于这些抗营养因子非常影 响幼小的家畜，大豆粉在幼小家畜的饲料中的使用受到限制。
未加工的大豆粉的TI活性是大约39mg/g，但脱脂的大豆粉的TI活性通常小于 4mg/g,因为抗营养因子在脱脂大豆粉的商业加工处理期间被热处理破坏。生长结束的 猪或母猪受抗营养因子的影响不是很大，但是不像生长结束的猪，由于抗营养因子，大 豆粉对刚断奶的猪的使用是受限制的。因此，可选的蛋白质的使用应被考虑由饲养步骤 区别。因为这个原因，加工处理的大豆产品诸如大豆蛋白质浓缩物或大豆蛋白质分离物 被用作饲料来获得与基于牛奶的饲养相似的生长表现。
目前的加工的大豆产品，诸如大豆蛋白质浓缩物6PC)、大豆蛋白质分离物 (SPI)或水解的大豆蛋白质通常通过食品加工用的物理/化学处理或酶促处理生产，并且 花费太高不能喂养家畜。
因此，为了将大豆粉用作高质量的蛋白质饲料，需要为其质量的改进研发价廉 并有效的、大规模的加工大豆蛋白质的方法。而且，最近的气候变化诸如全球变暖降低 了谷类产量，被用作饲料来源的谷物或大豆粉的国际价格上涨，使饲料和家畜工业受到 严重损害。因此，这种需要正快速地增长。
除了上面描述的Tl，大豆粉还已知含有引起腹泻和腹痛的大豆寡糖和抑制营养 吸收的多糖。大豆粉与饲料的混合物经常引起肠炎，但是其原因未被阐明。提示肠炎 被归因于大豆粉中酒精溶性多糖[Krogdahl，A.et al.Feeding atlantic Salmo salar L.soybean products.Aquac.Nutr.6, 77-84，200]。此外，有报道大豆多糖抑制鱼类诸如鲑鱼和肉鸡中营养物的吸收[Refstie, S.et al.Non-starch polysaccharides in soybean meals and effects on the absorption of nutrients in farmed Atlantic salmon and broiler chickens.Anim.Feed Sci. Technol.79, 331-3451999]。
因此，为了通过去除抗营养因子生产高质量的饲料，许多研究已在没有肌醇六 磷酸的肌醇六磷酸酶处理的大豆蛋白质产品(HP300 (Demark) -www.hamletprotein.com) 或发酵的大豆蛋白质(韩国专利号10-0645284、10-0459240和10-0925173，Livestock Research for Rural Development 20 (9) 2008)上进行。
这些之中，发酵的大豆蛋白质被报道为易消化并最佳吸收的高质量饲料添加 剂，因为在发酵加工过程中，多数抗营养因子能被去除并且蛋白质或碳水化合物被降解 为可消化的形式。
然而，在发酵加工过程中，需要超过任何预测水平的较长发酵时间来去除抗营 养因子(在韩国专利号10-0645284中是36小时，而在韩国专利号10-0459240中是48小 时)。这样长的发酵时间增加发酵罐批循环，导致总成本的增加。就这一点而论，由于 长的发酵时间，在现有技术中的问题是增加发酵大豆粉的生产加工期间的总成本。
直到现在，还未见报道杆菌菌株，特别地，枯草杆菌(B.sUbtilis)TP6被用于生产 发酵大豆粉同时减少发酵时间。同样，没有通过利用蛋白酶和功能多糖或通过应用益生 微生物的效力生产的产品，功能多糖是在大豆粉的固态发酵期间通过杆菌产生的。发明内容
技术问题
因此，本发明人已进行了许多努力为改善或改进作为饲料蛋白质来源的大豆粉 的质量来构建发酵大豆粉的生产系统并为减少总成本而减少发酵时间。本发明人发现具 有适于大豆粉固态发酵的特性的枯草杆菌TP6被采用以进行大豆粉的固态发酵，从而增 加蛋白质的含量和质量，提高消化和吸收速度——这通过缘于大豆蛋白质的水解的低分 子化、TI失活或抗营养因子诸如不可消化的多糖的含量减少实现，以及显著地改进是已 知发酵大豆粉的生产方法中障碍的发酵时间。最终，他们制备了高质量的发酵大豆粉， 引出了本发明。
在本申请各处，各种出版物被引用。为了更充分地描述与本发明有关的技术状 态，这些出版物的公开内容以其全部作为参考被并入本申请。
技术方案
本发明的目的是提供通过使用杆菌菌株，特别地，TP6菌株经固态发酵生产发 酵大豆粉的方法，它能有效地去除抗营养因子并具有优良的蛋白质消化能力以使发酵大 豆粉生产的发酵时间减到最小。
本发明的另一个目的是提供通过杆菌菌株发酵的高质量发酵大豆粉。
通过阅读下面的详细描述和所附的权利要求书并参考附图，本发明的其它的目 的和优点将变得明显。
有益的效果
本发明的特点和优点被概述如下
(a)本发明提供通过使用杆菌菌株，特别地，TP6菌株进行的固态发酵生产具4有改善或改进的特性的高质量发酵大豆粉的方法，它能有效地从大豆粉中去除抗营养因 子。
(b)特别地，本发明使用枯草杆菌TP6菌株，它能生产具有与用本领域已知的方 法生产的大豆粉相等或更好的质量的最终产品，同时将发酵时间减少达12至对小时。本 发明生产的发酵大豆粉是高质量的蛋白质来源，其中强效产蛋白酶杆菌通过水解使TI失 活并通过将大豆蛋白质低分子化为肽而改进消化和吸收速度。
(c)发酵时间的减少减少了发酵罐批循环以显著地增加年产量，导致总成本的降 低。结果，高质量的发酵大豆粉能以低价格供应给消费者。
(d)在本发明的方法中，在固态发酵中罕见的杆菌菌株被用作发酵菌株。由此， 本发明生产的发酵大豆粉变成高质量的蛋白质来源，其中强效产蛋白酶杆菌通过水解使 TI失活并通过将大豆蛋白质低分子化为肽而改进消化和吸收速度。
(e)而且，由本发明的方法生产的发酵大豆粉通过杆菌菌株的活跃生长产生高质 量的细胞蛋白质，由此增加蛋白质的绝对量并消耗大豆粉中作为生长需要的能源的碳水 化合物，引起蛋白质相对含量的增加。因此，它作为蛋白质饲料的价值被更多地改善。
(f)即使在配给期间，本发明生产的发酵大豆粉含有具有强生存能力的杆菌菌 株，因此它具有帮助喂养的动物肠调节的优点。考虑到积极推荐使用益生菌剂作为无抗 生素饲料的替代品，本发明的发酵大豆粉在未来将更具价值。
(g)此外，在本发明中，具有产生聚谷氨酸能力的杆菌菌株被用于进行大豆粉的 发酵，借此获得减少家畜体脂的附加效果。
当家畜为了促进其生长被用高能饲料喂养时，体脂堆积增加。最近，因为消费 者对健康的关注增加，他们希望摄取减少的脂肪。因此，需要的是能减少家畜体脂的饲 养方法或饲料开发。聚谷氨酸是在韩国清麴酱(chungkukjang)或日本纳豆(natto)中发现 的粘性的粘液物质，并且是具有多种功能的功能成分。特别地，它对动物脂肪减少的作 用近来已被显示。
(h)如上面所描述的，本发明的发酵大豆粉具有高质量和各种功能，因此被广泛 用于作为高蛋白质来源的饲料。此外，与已知的方法相比，发酵时间能被减少达12至对 小时。


图1是显示根据本发明的一个实施方式通过使用大豆粉作为原料生产发酵大豆 粉的流程图的示意图2是单一和混合培养期间SMB的胰蛋白酶抑制剂活性的变化图，是当进行植 物乳杆菌(L.plantaram)P23和枯草杆菌TP6的每个单培养以及植物乳杆菌P23和枯草杆菌 TP6的共培养时，显示胰蛋白酶抑制剂活性变化的图3是混合培养期间SDS-PAGE图式的变化图，是当进行植物乳杆菌P23和枯 草杆菌TP6的每个单培养和植物乳杆菌P23和枯草杆菌TP6的共培养时，显示蛋白质型 式的变化；其中在48h中，泳道1.原物质(水含量60%) ； 2.TP6(水含量70% )； 3.ΤΡ6(水含量 100% ) ； 4.ρ23(水含量 70% ) ； 5.p23 (水含量 100 % ) ； 6.ΤΡ6+ρ23(水 含量70%); 7.ΤΡ6+ρ23(水含量100% )；在72h中，泳道1.原物质(水含量60% )；2.TP6(水含量 70% ) ； 3.ΤΡ6(水含量 100 % ) ； 4.ρ23(水含量 70% ) ； 5.ρ23(水含量 100% ) ； 6.ΤΡ6+ρ23(水含量 70% ) ； 7.TP6+p23 (水含量 100% )；
图4是未鉴定的半乳糖-寡糖图，显示没接种细菌的热处理的大豆粉的糖分析的 色谱；
图5显示通过枯草杆菌ΤΡ6发酵的大豆粉的糖分析的色谱；
图6显示通过枯草杆菌ΤΡ6和植物乳杆菌Ρ23发酵的大豆粉的糖分析的色谱；和
图7显示枯草杆菌ΤΡ6表达对蛋白质降解和变应原去除的影响(标记物； (1)未加工的大豆粉；(2) 37 0C 45 % ； (3) 37 °C 50 % ； (4) 45 °C 45 % ； (5) 450C 50% ) ο
最佳实施方式
根据达到上述的目的一方面，本发明涉及生产发酵大豆粉的方法，包括步骤 (a)将水加入到大豆粉中来进行热处理；(b)冷却热处理的大豆粉，然后在其中接种杆菌 菌株；和(c)通过接种杆菌的大豆粉的固态发酵获得发酵大豆粉。
本发明人为大豆粉质量改善或改进以及发酵时间减少的目的，已进行了努力来 构建大豆发酵的生产系统。他们发现杆菌菌株被用作发酵菌株来进行大豆粉的固态发 酵，借此生产没有上述提到的问题的发酵大豆粉。
生产本发明的发酵大豆粉的方法关于下面的步骤将被详细地描述
(a)将水加入到大豆粉中和热处理
为了保持作为终产品的发酵大豆粉的质量，优选本发明的方法中使用的大豆粉 每次从相同的来源被供应。然而，最终发酵大豆粉的质量差别被归因于原料的初始营 养组成的差别所致，这只影响发酵大豆粉的最终营养组成，但并不影响发酵本身。特别 地，依赖其类型的大豆粉蛋白质含量的区别影响终产品的蛋白质含量。优选地，因为本 发明方法中使用的大豆粉显示较高的蛋白质含量和较低的胰蛋白酶抑制剂含量，发酵大 豆粉的质量被改进。
根据本发明的方法，在未加工的大豆粉热处理之前，需要加入水的过程。艮口， 在固态发酵前，适量的水被直接地喷到未加工的大豆粉上，并被混合以控制含水量，跟 着是预定的时间的热处理。在这一点上，进行热处理为了杀死未加工的大豆粉中的各种 病菌、大豆细胞壁的破坏和蛋白质变性的目的，借此提供期望的微生物的活跃生长的化 学组成。
根据本发明优选的实施方式，在步骤(a)中加水的大豆粉具有30至80% (v/w) 的水份含量，更优选地30至70 % (v/w)，和最优选地40至60 % (v/w)。30至80 % (ν/ w)范围的水分含量是优选的，以便由于低湿度引起的发酵延迟能被阻止，发酵之后转运 和干燥处理的成本能被减少，并且加热效率能被提高。
随后地，加水的大豆粉被进行热处理。热处理过程能通过本领域已知的各种方 法进行，但是蒸汽或过热蒸汽是优选的。
在本发明的方法中，如下进行步骤(a)的热处理使用温度范围在70至130°C 的蒸汽10至60η ι或温度范围在200至300°C的过热蒸汽温度几秒至几分钟的短时间，更 优选地温度范围在70至130°C的蒸汽10至30η ι，和最优选地温度范围在80至121.1°C 的蒸汽10至30mino
在根据本发明方法的热处理的进行中，如果热处理的温度低或处理时间短，就 存在对各种病菌的灭菌效果不充分或后来的发酵过程不能流畅进行的问题。如果热处理 的温度高或处理时间长，蛋白质变性在大豆粉中发生，减少消化速度，导致终产品的质 量降低。因此，优选的是采用可接受范围内的热处理的温度和时间以避免这些问题。
通过本发明方法的热处理，大豆粉中存在的污染物几乎被全部地去除，适合随 后固态发酵的化学环境被形成，并且TI抑制消化速度被轻微地减小。
在本发明优选的实施方式中，选择和预培养具有良好的蛋白质降解能力的杆菌 菌株被进一步包括在步骤(a)之前或之后。
诜择和预培养发酵菌株
在固态发酵中，在低湿度条件下生长良好的真菌诸如米曲霉(Aspergillus oryzae) 由于固体底物的低含水量而被普遍使用。然而，当真菌被用于进行大豆粉的发酵时，产 生的、发酵大豆粉是处于不适于饲料用途的状态。通过真菌与杆菌共培养的大豆粉生产 在韩国专利号10-0645284中被描述。然而，有各种缺点，因为同时培养它们两个实际上 不是容易的(真菌在低湿度下生长良好，但是细菌需要更多的湿度来生长)，并且通过后 加入它们之中的任何一个的后培养应被进行以生产产品。在这一点上，整个过程变得复 杂(每个菌株的种子培养/主要培养应被进行，接种时间和条件根据每个菌株而不同)， 水分含量也应根据每个条件被改变。结果，过程的复杂引起成本的大量增加。
因此，为了简化程序，优选的是选择这样的菌株，该菌株能生产具有与通过已 知的复杂共培养一段长的发酵时间生产的大豆粉相等或更好质量的终产品，并使发酵时 间减到最小以减少总成本。
与真菌相比，细菌在低湿度条件下生长不佳。因此，为了通过将杆菌接种到大 豆粉中而达到本发明的目的，必须使用在具有低含量水的大豆粉中生长良好并在生长过 程中生产大量期望酶的菌株。
在工业规模的固态发酵设备中，供应对培养微生物充足的氧是困难的。因此， 优选的是使用杆菌菌株作为大豆粉的发酵菌株，它在低氧条件下生长良好并具有优良的 蛋白质水解活性。此外，为了进一步改进本发明发酵大豆粉的价值，更优选的是分离充 当产孢子益生菌剂的菌株。最近，将抗生素加入到饲料中是全世界禁止的。作为无抗生 素饲料的替代物，被积极推荐的是使用具有许多种生理功能的益生菌剂，诸如通过肠道 菌群改善、有害细菌繁殖抑制的健康促进，以及免疫、疾病抵抗力或饲料效率的改进。 传统地，乳酸杆菌被用作益生菌，但是新近产孢子细菌被认作为益生菌，借此增加产孢 子细菌作为被加入到无抗生素饲料中的益生菌的兴趣。产孢子益生菌的有代表性菌株是 杆菌菌株。
有许多努力来从亚洲传统的固态发酵的大豆食品诸如豆瓣酱、清麴酱或印尼豆 豉(Tempeh)中分离满足本发明目的的杆菌菌株，导致分离到大量的杆菌菌株。
根据本发明的优选实施方式，被选择用在本发明中的杆菌菌株是枯草杆菌 (Bacillus subtilis)、赌状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) 或克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)。
枯草杆菌是更优选的，枯草杆菌TP6菌株(KFCC 11343P,专利号10-0753002)是最优选的。
特别地，枯草杆菌TP6菌株(在下文被称作“TP6菌株”)在需氧和厌氧条件 下，在具有40%或更大低水分含量的大豆粉中生长良好，显示优良的大豆蛋白质水解活 性，并在发酵后期中具有产生聚谷氨酸的独特性质。此外，当枯草杆菌TP6菌株被使用 时，与已知的方法相比，发酵时间被显著地减少。
本发明的菌株可被进一步选作被用于乳酸杆菌或乳酸杆菌与杆菌菌株的混合菌 株接种的菌株。
从奶或奶酪中分离的动物乳酸杆菌使用乳糖生长，但是从蔬菜中分离的植物乳 酸杆菌利用各种糖诸如葡萄糖、果糖或麦芽糖并具有高的环境适应以在苛刻条件诸如低 pH下存活。因此，植物乳酸杆菌较动物乳酸杆菌在胃中显示较高的存活率，并且许多菌 株到达肠。
因此，术语“植物乳酸杆菌”，如本文所使用的，指从植物来源得到的乳酸杆菌。
据说朝鲜泡菜是植物乳酸杆菌的代表性来源。当制作泡菜时，调味品诸如辣的 红胡椒和大蒜被加入。这时，由于泡菜乳酸杆菌被暴露在较其它乳酸杆菌更苛刻的条 件，它存活以显示优良的降解能力和营养摄取以及各种生理活性物质的生产力。
因此，当从泡菜中分离的植物乳酸杆菌被用于进行大豆粉的发酵时，乳酸杆菌 有望无需添加辅助物质而活跃生长并在发酵期间产生抗微生物物质、功能肽或有机酸。
在本发明中，本发明人已做了很多努力来从泡菜中分离适于大豆粉发酵的乳酸 杆菌。根据本发明的优选实施方式，选择的乳酸杆菌优选是沙克乳酸菌(Lactobacillus sakei)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)或植物乳杆菌(Lactobacillus plantaram),更优 选的是植物乳杆菌，和最优选的是由本发明人从泡菜中分离的植物乳杆菌P23(KCCM 80048)。
在本发明中，植物乳杆菌P23菌株(在下文被称作“P23菌株”)被发现显著减 少在大豆粉中存在的抗营养因子——非淀粉多糖，并显示优良的产生有机酸能力和耐酸 性。
从泡菜中分离的乳酸杆菌的种子培养的培养基可以是本领域已知的任何培养 基，优选 MRS 肉汤(deMan Rogosa Sharpe broth)、APT (All Purpose with Tween)或BHI(脑-心灌注)，更优选地是MRS肉汤。然而，由于MRS肉汤对工业应用来说太 贵，本发明人为乳酸杆菌的种子培养构建了价廉的培养基，并且CSL(玉米浸渍液)被用 作乳酸杆菌种子培养的碳和氮源。
此外，对于杆菌的种子培养，改良的培养基(5g/L大豆胨、5g/L牛肉膏和20g/ L木糖，pH7.0)被优选地用于在37°C培养12至对小时。这种培养基还可增加工业用途 的大规模生产的成本价格，并因此优选在基于本发明人设计的CSL的工业培养基上培养 杆菌。
对于乳酸杆菌的种子培养，从泡菜中分离的乳酸杆菌被接种到本发明人设计的 工业培养基中，并在30°C培养8至对小时，从而获得期望菌株的活性。
两个菌株中的每一个在种子培养的工业培养基中培养，直到种子培养基中最终 的活细胞数变成(1-5) X 109cfu/mL。
(b)热处理的大豆粉的冷却和微生物的接种
根据本发明的方法，在步骤(b)中，热处理的大豆粉被冷却到固态发酵能被进 行的温度，然后杆菌被接种到其中。
在本发明中，大豆粉的冷却通常在热处理之后进行，其中为了防止过热，冷却 过程能通过使用冷却运送机的转移过程而被容易地进行，并通过增加冷却速度而均勻地 冷却(图1)。
根据本发明优选的实施方式，本发明方法中步骤(b)的冷却的大豆粉具有30至 50°C、更优选地35至45°C、和最优选地37°C的温度。
冷却热处理的大豆粉之后，根据本发明的优选实施方式，优选的是杆菌菌株的 预培养基被均勻地接种到如此制备的大豆粉培养基或用灭菌水稀释的制备的大豆粉培养基中。
被接种到热处理的大豆粉中的微生物数目是影响大豆粉固态发酵的重要因素。 接种到热处理的大豆粉之后即刻微生物数目优选是IO5至lOtFU/g。如果接种量少于 105CFU/g,需要少量的种子发酵肉汤，但是大豆粉的发酵需要许多时间来增加温育时间 和污染的可能性。如果接种量多于lOtFU/g，发酵时间能被大大减少，但是用于接种的 种子微生物的产生是有问题的。特别地，由于发酵情况受微生物的生长特性和发酵罐的 类型影响很大，优选的是接种量根据生产步骤中微生物的特性正确适当地确定。
(c) iM寸撫Φ木干麵±痛_■■體舗妨粉
本发明的一个特点是通过将杆菌接种到大豆粉中而生产发酵大豆粉，其中不像 真菌或酵母，杆菌通常不被用于固态发酵(培养)。
如本文所有用，术语“固态发酵(培养)”指通过从大豆中去除油获得的脱脂大 豆粉被用于培养微生物，并区别于使用大豆粉提取物的“液态培养或液态发酵”。
由于一些微生物在固态发酵过程中生长良好并产生大量胞外酶和其它的代谢产 物，固态发酵在亚洲已被用于传统食品或酒精饮料的生产。大豆粉是薄片或颗粒状态的 固体底物，因此使用微生物的固态发酵是能改进作为饲料的大豆粉的价值的价廉和有效 的方法。
为了利用本发明方法中的固态发酵，使用选自杆菌菌株的菌株，根据发酵大豆 粉的终产品的性质，可以控制菌株类型和接种方法。优选地，枯草杆菌ΤΡ6菌株被用于 减少本发明的发酵时间。
在通过只有杆菌接种生产发酵大豆粉的情况下，杆菌菌株活跃地生长以改进发 酵大豆粉的质量，在这时，杆菌菌株首先产生具有强力活性的蛋白酶。杆菌产生的蛋白 酶特征在于其通过水解使TI失活，并通过缘于大豆蛋白质水解所致的低分子化改善消化 和吸收速度，其中TI是抑制大豆粉消化的蛋白质。
此外，当杆菌菌株通过利用大豆粉成分中的碳水化合物活跃地生长时，碳水化 合物被转化为构成细胞的蛋白质。因此，大豆粉的相对蛋白质含量在发酵期间增加，这 是饲料质量的评价项目中最重要的因素。
在干燥处理期间，在大豆粉中生长的杆菌菌株形成孢子从而以高的比率存活， 因此它们甚至在干燥发酵大豆粉之后作为活细胞存在。由于杆菌的孢子形成，它被期望 作为上面描述的孢子形成益生菌显示改善家畜中肠功能的作用。
在本发明的方法中，乳酸杆菌可被单独接种或与杆菌混合接种。当仅仅接种从泡菜中分离的植物乳酸杆菌时，它通过利用作为原料的大豆粉生长良好，产生大量有机 酸。此外，植物乳酸杆菌具有α-半乳糖苷酶活性，所以显示降解大豆粉中含有的半乳 寡聚糖的性质，并水解大豆粉中的各种多糖抗营养因子，从而预防肠炎并改善营养物吸 收的速度。
为了产生具有两种细菌的所有优点的发酵大豆粉，它们可被同时地或以时间间 隔依次被接种。此外，由于两种细菌的生长条件互不相同，就终产品的质量而言，优选 的是它们以不同的比率或依次被接种。然而，这不是指同时接种或以相同的比率接种就 不能达到期望的效果。
根据本发明的优选实施方式，被用期望的微生物均勻接种的大豆粉在步骤(C)的 填充床发酵罐中被发酵。填充床发酵罐被分成间歇、密闭和连续搅拌釜反应器。本发明 的方法不限于它们中的任何一个，并且它能根据生产规模被选择。
在本发明中，大豆粉以5至50cm的厚度应用于填充床发酵罐，并在20至50°C 的温度发酵12至72小时。
(d)获得的发酵大豆粉的干燥和粉碎
根据本发明的优选实施方式，本发明的方法进一步包括步骤(C)之后步骤(d)在 低温和低湿度中干燥并粉碎发酵大豆粉。
大豆粉中含有的水在发酵过程期间被部分蒸发，但是发酵之后即刻剩余的水含 量是相当地高，在20至50% (v/w)。然而，发酵大豆粉产品优选的最终含水量是10至 12% (v/w),因此干燥处理是需要的。
当使用真菌诸如米曲霉发酵大豆粉时，大豆粉变硬并通过菌丝体产生形成成团 物，由于孢子，进行干燥和粉碎处理非常难。期间，当使用本发明的细菌进行发酵时， 发酵大豆粉处于良好的状态，但是成团物轻微形成。因此，干燥处理之后，需要粉碎发 酵大豆粉的处理以形成均勻的颗粒大小。
干燥和粉碎处理可通过本领域已知的各种方法进行。然而，当干燥处理在高温 被过度进行时，发酵大豆粉中的许多活细菌可能被杀死，因此应小心进行。优选地，干 燥处理在低温进行而不杀死活细菌。最优选地，干燥处理在低温和低湿度中用热空气进 行。根据使用的目的，发酵大豆粉可被粉碎成各种大小，而优选地使用锤磨机。
当大豆粉根据本发明的上述方法被发酵时，大豆粉中包括TI在内的各种抗营养 因子被减少，消化和吸收速度通过蛋白质的水解而被提高，从而改善作为饲料的绝对价 值。结果，高质量的发酵大豆粉能作为动物蛋白质的替代物被获得。
甚至在配给期间，用本发明方法生产的发酵大豆粉含有具有强生存力的杆菌菌 株，因此它具有帮助被喂养的动物的肠调节的优点。
在另一个方面，本发明涉及通过本发明方法生产的发酵大豆粉。
由于本发明的发酵大豆粉通过本发明的上述方法生产，这里共同的描述将被省 略以避免冗余。
在通过接种枯草杆菌TP6菌株产生的发酵大豆粉中，杆菌菌株活跃地生长以改 进发酵大豆粉的质量，并且这时，杆菌菌株首先产生具有强力活性的蛋白酶。杆菌产生 的蛋白酶特征在于其通过水解使TI失活，并通过缘于大豆蛋白质水解所致的低分子化改 善消化和吸收速度，其中TI是抑制大豆粉消化的蛋白质。此外，当杆菌菌株通过利用大豆粉成分中的碳水化合物活跃生长时，碳水化合物被转化为构成细胞的蛋白质。因此， 大豆粉的相对蛋白质含量在发酵期间增加，这是饲料质量的评价项目中最重要的因素。 此外，在干燥处理期间，在大豆粉中生长的杆菌菌株形成孢子从而以高比率存活，因此 它们甚至在干燥发酵大豆粉之后作为活细胞存在。由于杆菌的孢子形成，它被期望作为 上述孢子形成益生菌显示出改善家畜中肠功能的作用。
根据本发明的一个优选实施方式，本发明的发酵大豆粉含有选自杆菌菌株，优 选地，枯草杆菌TP6菌株的微生物的营养细胞或孢子。
根据本发明的另一个优选实施方式，本发明的发酵大豆粉含有聚V-谷氨酸，减 少体脂在家畜中的积累。
根据本发明的另一个优选实施方式，杆菌菌株包括枯草杆菌TP6菌株。
[发明的实施方式]
以下，本发明将参考实施例被更详细地描述。将对本领域技术人员明显的是， 这些实施例只是为了例证性的目的，本发明并不意欲被限制在这个范围中。实施例
本申请自始至终，“％”被用来表示特定物质的浓度对于固体/固体是(重量 /重量)％，对于固体/液体是(重量/体积)％，对于液体/液体是(体积/体积)％， 除非例外说明。
^MM ι 根据大豆粉的7k分含量的杆If禾PMfflf的牛长
为了确定适于细菌培养的大豆粉的水分含量，水以30%、40%, 50%和60%的 含水量被加入到大豆粉中，50g加水的大豆粉被放到烧杯Q50mL)中。然后，烧杯的顶 部用铝箔盖住，并用橡皮筋扎紧。在80°C进行热处理30η ι，接下来冷却。
根据本发明的一个实施方式，使用优选的枯草杆菌TP6(KFCC 11343P)(以下被 称作“TP6”菌株)和植物乳杆菌P23(KCCM80048)(以下被称作“P23”菌株)进行大 豆粉发酵。含有木糖2%、大豆胨0.5%和牛肉膏0.5%的培养基被用于TP6菌株的种子 培养，使用MRS肉汤(Difco)在37°C的温度将P23菌株预培养M小时。
当热处理的大豆粉被冷却到大约30°C时，在洁净台中，在种子培养基中预培养 的每种菌株的5%被接种到具有不同水含量的热处理大豆粉中。为了防止污染和水分蒸 发，烧杯用铝箔紧紧地密封，并在培养箱中在37°C被发酵72小时。随后，测定每个发酵 大豆粉中的细菌数目和pH值。结果被概述在下面的表1中。
[表1]
P23和TP6菌株在具有不同含水量的大豆粉中的生长
权利要求
1.生产发酵大豆粉的方法，包括步骤(a)将水加入到大豆粉中以进行热处理；(b)冷却热处理的大豆粉，然后向其中接种杆菌菌株；和(c)通过所述杆菌接种的大豆粉的固态发酵获得发酵大豆粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)所述加水的大豆粉具有30至80%(ν/ w)的含水量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)所述大豆粉的热处理在70至130°C的温 度进行10至30η ι。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)所述冷却的大豆粉在30至50°C的温度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)所述杆菌菌株选自枯草杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusii^gaterium)和克劳氏 芽孢杆菌(Bacillus clausii)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述杆菌菌株是枯草杆菌TP6菌株。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(C)的固态发酵在20至50°C的温度进 行12至72小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括步骤(C)之后步骤(d)干燥 和粉碎发酵大豆粉。
9.一种发酵大豆粉，其由根据权利要求1至8中任一项所述的方法生产。
10.根据权利要求9所述的发酵大豆粉，其中所述发酵大豆粉含有杆菌菌株的营养细 胞或孢子。
11.根据权利要求10所述的发酵大豆粉，其中所述发酵大豆粉含有聚-Y-谷氨酸。
12.根据权利要求10所述的发酵大豆粉，其中所述杆菌菌株是枯草杆菌TP6菌株。
全文摘要
本发明涉及生产发酵大豆粉的方法，包括步骤(a)将水加入到大豆粉中以进行热处理；(b)冷却热处理的大豆粉，然后向其中接种杆菌菌株；并(c)通过接种杆菌的大豆粉的固态发酵获得发酵大豆粉，以及涉及由该方法生产的发酵大豆粉。本发明的方法使用具有发酵大豆粉的生产需要的优良性质的杆菌菌株，特别地，枯草杆菌TP6菌株作为发酵菌株。因此，本发明生产的发酵大豆粉是高质量的植物蛋白质来源，因为包括胰蛋白酶抑制剂、大豆寡糖和多糖在内的各种抗营养因子几乎都被去除，它的蛋白质含量高，并且消化和吸收速度也通过蛋白质的低分子化被提高。特别地，能去除抗营养因子的TP6菌株被用于将产品质量改进到与由已知的发酵大豆粉产生的产品质量相等或更好，同时减少发酵时间，因此显著地增加年生产量。
文档编号A23K1/14GK102018096SQ20101027781
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月8日 优先权日2009年9月9日
发明者卞裕亮, 姜姓熙, 徐尚铉, 朴承源, 朴贤镐, 柳济熏, 池玄, 洪暎镐, 赵成捘, 赵石铁, 鞠武昌 申请人:Cj第一制糖株式会社