专利名称：一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法
技术领域：
本发明涉及动物生物技术、具体是一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法。
背景技术：
水牛是我国南方主要大家畜之一，具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、 使用年限长等生物学特性，非常适合我国南方农村饲养。开发利用水牛畜种资源，将现有的役用水牛转化为乳用或乳肉兼用的商品水牛，是水牛畜牧产业发展的趋势。然而目前水牛的繁殖率很低、种群的生产性能低劣，急需发展和完善一批与家畜遗传改良密切相关的农业高技术来提高水牛繁殖力和产奶量。利用胚胎工程技术，特别是转基因动物技术，是培育动物新品种以及培育动物抗病新品种的一条有效技术措施。2002年，人们首次将慢病毒载体法应用到转基因动物研究，并在猪、牛等多种动物取得了成功。慢病毒载体转基因具有以下优点能感染分裂细胞和非分裂细胞；能转染多种组织，包括早期胚胎细胞；能稳定整合和长期表达外源目的基因；不易诱发宿主免疫反应；可兼容多个启动子等。这些优点使得慢病毒载体法成为转基因动物方法学上的一个新的突破。相对于其他物种来说，水牛体细胞和胚胎不易被外源基因感染，基因转染的效率较低，同时，外源目的基因不易稳定整合和长期表达；这为获得水牛转基因胚胎及生产转基因水牛增加了难度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，以适应水牛品种改良的需要。本发明以如下技术方案解决上述技术问题一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，包括如下步骤1、高滴度慢病毒包装采用传代培养的四31~细胞以及3质粒包装系统和磷酸钙转染方法进行慢病毒包装。转染前，将细胞以IX IO5ceIlsAiL的密度传代于经多聚赖氨酸处理的培养皿中，用10% DMEM培养液于体积百分比为5% CO2的37°C培养箱中培养， 生长到70 80%汇合度时备用。转染前lh，将培养基更换成无血清无双抗的DMEM。转染时，将3个质粒即15 μ g载体质粒、10 μ g包膜蛋白质粒ρ Δ8. 9、5 μ g包装质粒pVSV-G和125 μ LCaCL2于试管中混合均勻，补足体积至500 μ L。将500 μ L含磷酸氢二钠、PH值为6. 95的转化液滴加入上述混合液中，室温静置30min。将质粒混合液逐滴加到 IOOmm培养皿的细胞中，于体积百分比为5% CO2的37°C培养箱中培养，第二天换正常培养液培养。转染后48 72h收集病毒。将收集的上清于1500rpm离心10min，0.45ym 滤器过滤收集病毒原液。将病毒上清以20000rpm离心力、4°C离心2h，用100 μ L的PBS重悬得到浓缩慢病毒，_80°C冷冻保存。病毒滴度的检测293T细胞以浓度2X IO5ceIlsAiL接种于M孔板中，每孔加 500 μ L DMEM培养液培养过夜。检测时将4 μ L病毒液加到500 μ L含2% FBS的DMEM培养液中混合均勻，换掉原有的培养液。48 7 观察绿色荧光蛋白表达情况并计数。
2、制作水牛转基因体细胞传代培养4 5代的水牛成纤维细胞用慢病毒原液进行感染。感染细胞时，除用DMEM和10%胎牛血清外，加入0 lOyg/ml polybrene。转染第2天，换正常培养液继续培养细胞并传代3次，在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白GFP表达情况。3、制作水牛转基因嵌合胚胎采用显微注射方法将浓缩慢病毒注入到水牛成熟卵母细胞透明带下或IVF受精卵中。水牛卵母细胞体外受精后，将慢病毒浓缩液30 70pL注射到水牛IVF受精卵，与颗粒细胞的单层体外共培养7 9天后，在荧光显微镜下检测囊胚GFP表达情况，筛选获得水牛转基因嵌合胚胎。4、转基因水牛生产将经受精卵原核注射法生产的转基因阳性胚胎移植到自然发情或同期处理发情的代孕母牛子宫内中，一头母牛移植2枚胚胎。2个月后B超观察妊娠状况，对妊娠水牛继续跟踪观察10个月。本发明突出的实质性效果采用本发明获得了高滴度慢病毒粒子，浓缩病毒平均滴度达到IO9以上。将病毒原液直接感染水牛成纤维细胞，阳性细胞感染率可达30%以上。采用受精卵原核注射法将浓缩病毒注射到水牛成熟卵母细胞透明带下或IVF受精卵中，M%以上转基因胚胎发育至囊胚阶段，40%以上囊胚表达外源基因。成功获得一头转绿色荧光蛋白GFP基因的转基因水牛。
图1是用本发明方法获得的慢病毒感染的水牛成纤维细胞的可见光图谱。图2是用本发明方法获得的慢病毒感染的水牛成纤维细胞的紫外光图谱。图3是用本发明方法获得的慢病毒感染的水牛胚胎的可见光图谱。图4是用本发明方法获得的慢病毒感染的水牛胚胎的紫外光图谱。图5是用本发明方法获得的慢病毒介导的转基因水牛实物图。
具体实施方案以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。本发明所述慢病毒载体生产转基因水牛的方法，包括如下步骤1、高滴度慢病毒包装采用传代培养的细胞以及3质粒包装系统和磷酸钙转染方法进行慢病毒包装。转染时，将3个质粒即15 μ g载体质粒、10 μ g包膜蛋白质粒ρ Δ 8. 9、5 μ g包装质粒 pVSV-G和125 μ LCaCL2于试管中混合均勻，补足体积至500 μ L。将500 μ L含磷酸氢二钠、 PH值为6. 95的TS转化液滴加入上述混合液中，室温静置30min。将质粒混合液逐滴加到 293T细胞中，于体积百分比为5% CO2的37°C培养箱中培养，第二天换培养液。转染后48 72h收集病毒。将收集的上清1500rpm离心10min，0. 45 μ m滤器过滤收集病毒原液。将病毒上清以20000rpm离心力、4°C离心2h，然后用100 μ L的PBS重悬得到浓缩慢病毒，_80°C 冷冻保存。经检测浓缩后病毒滴度达ιχιο9ιυ。2慢病毒感染水牛成纤维细胞传代培养4 5代的水牛成纤维细胞用慢病毒原液进行感染。感染细胞时，除用DMEM和10%胎牛血清夕卜，加入0 10μ g/mlpolybrene。转染第2天，换正常培养液继续培养细胞并传代3次，在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白GFP 表达情况，获得感染率达30%以上的转基因细胞。3、慢病毒感染水牛植入前胚胎采用显微注射方法将浓缩慢病毒注入到水牛成熟卵母细胞透明带下或IVF受精卵中。水牛卵母细胞体外受精IVF 从当地屠宰场收集水牛卵巢，装在30°C生理盐水保温瓶中4h内送回实验室。采用12号针头的IOmL注射器抽取卵丘细胞-卵母细胞复合体COCs，在体视显微镜下将细胞质均勻并有完整或部分致密卵丘细胞的COCs捡出，放入含 1. 5mL卵母细胞体外成熟液的30X IOmm玻璃平皿中培养22 Mh。体外成熟的卵母细胞进行体外受精IVF。胚胎卵周隙病毒显微注射实验所用的病毒注射管内径均为5 6μπι，固定针管内径为20 μ m，购自美国HUMAGEN公司，产品目录号MIC-35-35。取一个60mm培养皿盖，在皿盖的中央做2个10 μ L的CCM小滴，用石蜡油盖过小滴，防止CCM蒸发。将其中一滴CCM 吸掉，以制备好的浓缩病毒代替；另外一滴加入体外受精卵。首先用注射管吸取一定量的病毒，然后转移至卵母细胞滴，用固定针吸住一个体外受精后的水牛胚胎，将其极体置于如时钟6点钟的位置，然后从3点钟位置进针，将病毒液缓慢注入胚胎的卵周隙。完成一批操作后，用CM液洗胚胎2次，放回培养箱中进行胚胎的体外培养。胚胎体外培养及移植注射病毒后的受精卵置于用黄牛颗粒细胞制备的单层微滴中，在38. 5°C、体积百分比为5%的(X)2培养箱中培养7 9天。CM液每隔4 更换一次， 培养24h后检查分裂率，荧光显微镜下检查EGFP在胚胎中的表达情况，记录不同发育阶段表达EGFP的胚胎个数。7天后记录发育的囊胚发育率。将镜检阳性的囊胚移入同期发情的的代孕母牛子宫内。(4)转基因水牛生产将经受精卵原核注射法生产的转基因阳性胚胎移植到自然发情或同期处理发情的代孕母牛子宫内中，一头母牛移植2枚胚胎。2个月后B超观察妊娠状况，对妊娠水牛继续跟踪观察10个月。实施例12009至2010年间，采用启动子为CMV的慢病毒对水牛IVF受精卵进行感染，分别注射了 582枚受精卵，154枚发育至囊胚阶段，占所注胚胎的26. 5%，其中66枚囊胚表达 GFP,占囊胚总数的42. 9%。取8枚阳性囊胚移植到4头代孕母牛子宫内，两个月后B超检查2头代孕母牛妊娠，其中于2010年12月17日诞生一头牛犊，PCR检测脐带基因组DNA样品，表达外源基因GFP及慢病毒表达元件基因，证明水牛受精卵卵周隙注射慢病毒可有效生产转基因水牛。实施例22009至2010年间，采用启动子为CMV、Ubc的两种慢病毒分别对不同发育时期的水牛IVF受精卵进行感染，分别注射了 466枚不同时期的受精卵，113枚发育至囊胚阶段，占所注胚胎的24. 2%，其中61枚囊胚表达GFP，占囊胚总数的54. 0%。此实例证明水牛不同发育时期受精卵卵周隙注射慢病毒可有效生产水牛转基因胚胎。
权利要求
1. 一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)高滴度慢病毒包装采用传代培养的细胞以及3质粒包装系统和磷酸钙转染方法进行慢病毒包装，转染时，将3个质粒即15 μ g载体质粒、10 μ g包膜蛋白质粒ρ Δ 8. 9、 5μ g包装质粒pVSV-G和125μ LCaCL2于试管中混合均勻，补足体积至500 μ L，将500 μ L含磷酸氢二钠、PH值为6. 95的TS转化液滴加入上述混合液中，室温静置30min，将质粒混合液逐滴加到细胞中，于体积百分比为5% CO2的37°C培养箱中培养，第二天换培养液， 转染后48 7 收集病毒，将收集的上清1500rpm离心lOmin，0. 45 μ m滤器过滤收集病毒原液，将病毒上清以20000rpm离心力、4°C离心2h，用100 μ L的PBS重悬得到浓缩慢病毒、 分装，_80°C冷冻保存，浓缩后病毒滴度达IXlO9IU以上，(2)制作水牛转基因体细胞传代培养4 5代的水牛成纤维细胞用慢病毒原液进行感染，细胞转染时，除DMEM和10%胎牛血清外，加入O 10 μ g/mlpolybrene，转染第2天， 换正常培养液继续培养细胞并传代3次，在荧光显微镜下检测细胞的绿色荧光蛋白GFP表达情况，获得感染率达30%以上的转基因体细胞，(3)制作水牛转基因嵌合胚胎水牛卵母细胞体外受精后，将慢病毒浓缩液30 70pL 注射到水牛IVF受精卵中，与颗粒细胞的单层细胞体外共培养7 9天后，在荧光显微镜下检测囊胚GFP表达情况，筛选获得水牛转基因嵌合胚胎，以上转基因胚胎发育至囊胚阶段，40%以上囊胚表达外源基因，(4)转基因水牛生产将经受精卵原核注射法生产的转基因阳性胚胎移植到自然发情或同期处理发情的代孕母牛子宫内中，一头母牛移植2枚胚胎，2个月后B超观察妊娠状况， 对妊娠水牛继续跟踪观察10个月。
全文摘要
一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，其步骤为首先进行高滴度慢病毒的包装及浓缩，对水牛胎儿成纤维细胞进行感染与筛选，采用显微注射法制作水牛转基因嵌合胚胎，将阳性胚胎移植到受体水牛。采用本发明的方法，成功获得了转外源基因的水牛成纤维细胞和转基因水牛嵌合囊胚，30％以上的体细胞表达外源基因，40％以上的囊胚表达外源基因，并成功获得一头转绿色荧光蛋白GFP基因的转基因水牛。
文档编号A61D19/04GK102174577SQ20111002533
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者刘庆友, 孟凡丽, 李湘萍, 石德顺, 罗婵, 蒋建荣, 陆凤花 申请人:广西大学