专利名称：一种抗烟草病毒RNAi载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA干扰(RNAi)载体及其构建方法，特别涉及一种同时抗PVY、CMV、TMV三种病毒的RNAi载体构建方法。
背景技术：
病毒病是烟草上普遍发生、危害严重的一大类病害。目前世界上已报道的侵染烟草的病毒达47种，中国有17种，其中分布广、危害严重的有马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)等。田间病毒病多混合发生，往往给烟草生产造成严重损失。病害流行的年份， 由病毒病造成的烟叶产量损失可达30% 50%，个别地区甚至绝产[1’2]。因此研究抗病毒方法尤其是同时抗多种病毒的方法在生产中显得尤为迫切和重要。防治烟草病毒病最有效的方法是种植抗病品种，但传统的抗病品种培育方法面临选育周期长、抗病基因与不良农艺性状基因连锁、抗源遗传基础狭窄以致生产上几乎没有能够抗多种病毒的品种以及抗病性容易丧失等问题。利用基因工程手段转化病毒的序列可以在较短时间内获得能同时抗多种病毒的转基因植株。其中最为成功的基因工程策略为RNA干扰(RNA interference, RNAi)[3' 4]。RNAi是真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制[5]。双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)被 Dicer 降解为 21_26nt 的小干扰 RNA(small interferingRNA, si RNA)，后者指导对同源RNA进行识别和切割，导致靶标mRNA的降解[6]。dsRNA形成的有效途径之一是将体外构建的反向重复结构(inverted repeats, IR)转入植株或工程菌转录合成。IR由一段间隔序列连接两段反向互补序列构成，转录后会形成发夹状RNA (hairpin RNA, hp RNA)。hp RNA由茎(stem，是反向互补序列转录的RNA 配对形成的双链)和环(loop，是间隔序列转录的RNA单链结构)组成。hpRNA中的茎是诱发序列特异性基因沉默的关键部份，茎的长短影响RNA沉默的效率和稳定性，501000bp的 dsRNA同源片段均能高效诱发转录后基因沉默[7]。转基因植株转录形成的dsRNA和体外合成后再导入植物dsRNA，都可以诱导植物降解入侵的病毒RNA[8’9]。但由于生产中不允许种植转基因烟草，因此利用其它方式诱导烟草植株产生对病毒的抗性更为实用。大肠杆菌可以表达dsRNA，但由于大肠杆菌中的RNaseIII可以将dsRNA切割成大小12-15bp的片段，这些短的dsRNA不能诱发基因沉默_。HTl 15 (DE 3)菌株是RNaseIII 的缺失体，可利用该菌株生产大量的dsRNA ；用大肠杆菌中产生的dsRNA处理植株，可以获得对病毒的抗性[11’12]。因此如何应用RNA干扰技术应用于烟草病毒，并培养相应的抗病植株，就成为了现在亟待解决的问题之一。
发明内容
基于上述的原因，发明人在分析了 PVY、CMV和TMV中国分离物的基因组特点后，选取了 PVY-CP、CMV-RNA1、TMV-CP基因中的保守且能高效诱导RNAi的三段序列。通过将这三部分嵌合并构建反向重复序列，得到一个RNAi载体pGEM-PCTRi，在导入HTl 15菌株后通过 IPTG诱导可以大量生产dsRNA，用dsRNA处理烟草，可诱导烟草产生对PVY、CMV、TMV三种病毒的抗性，对于采用RNA干扰技术来获得抗病毒植株的研究，提供了良好的参考借鉴作用。本发明所提供的RNAi载体，发明人将其命名为pGEM-PCTRi，其是通过将PVY-CP、 CMV-RNAU TMV-CP基因中的保守且能高效诱导RNAi的三段序列嵌合并构建反向重复序列获得的，其序列如Seq ID No 1所示。其中发明人所选取的PVY-CP、CMV-RNAU TMV-CP基因中的保守且能诱导RNAi的三段有效序列，其序列分别如Seq ID No :2、Seq ID No 3和Seq ID No :4所示，具体如下表
权利要求
1.一种抗烟草病毒RNAi载体，其序列如Seq ID No 1所示。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于是通过将PVY-CP、CMV-RNA1、TMV-CP基因中的保守且能高效诱导RNAi的三段序列嵌合并构建反向重复序列获得的；其中PVY-CP、CMV-RNAl、TMV-CP基因中的保守且能诱导RNAi的三段有效序列，其序列分别如 Seq ID No :2、Seq ID No 3 和 Seq ID No 4 所示。
3.如权利要求1所述载体，在转化HTl15菌株后，获得大肠杆菌ECHT115-PCTRi，其生物保藏编号为=CGMCC NO. 4404。
4.如权利要求1所述载体在导入HTl15菌株后通过IPTG诱导可以大量生产dsRNA的应用。
5.如权利要求1所述载体在烟草田间生产中预防病毒病的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，提供了一个能介导对我国烟草病毒病抗性的RNAi载体pGEM-PCTRi。通过对我国烟草主要病毒马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)群体基因组特性的分析，选取了PVY CP、CMV RNA1和TMV CP基因中的保守且能诱导RNAi的三段有效序列；将三部分嵌合并构建反向重复序列，得到一个RNAi载体pGEM-PCTRi。利用该载体可以在大肠杆菌中大量生产dsRNA，处理烟草后可诱导烟草产生对PVY、CMV和TMV的抗性。本发明有应用于烟草田间生产中预防病毒病的潜力，且具有广谱、高效、不涉及转基因等优势。
文档编号A01P1/00GK102220361SQ201110117239
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者李向东, 贾金磊 申请人:山东农业大学