Eno2基因在植物生长发育调控中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供ENO2基因在植物生长发育调控中的应用，利用基因工程技术将ENO2基因整合至植物基因组中，从而调节植物的生长发育。研究表明：1、eno2产生的T-DNA插入突变使得拟南芥花粉形态异常，由此可见eno2在花粉的正常发育中起重要作用；2、eno2产生的T-DNA插入突变使得拟南芥的主根长度明显变短、莲座叶的叶片数目变少和总面积显著变小、所有叶片都成为网状叶和地上及地下部分重量明显降低。由此可见eno2在拟南芥的正常营养生长发育中起重要作用。
【专利说明】EN02基因在植物生长发育调控中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及EN02基因在植物生长发育调控中的应用。
【背景技术】
[0002]烯醇化酶(enolase，eno)是参与糖酵解的一个关键酶，近年来发现烯醇化酶还表现出一些其他的、多样化的新功能。在植物体中，研究者早已观察到烯醇化酶在转录、转录后和翻译后水平上应答高盐、低温、缺氧等非生物胁迫，因此，推测烯醇化酶可能在植物非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。然而，目前为止鲜有文献报道烯醇化酶在植物生长发育中起作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供EN02基因在植物生长发育调控中的应用。
[0004]为了实现本发明目的，本发明利用基因工程技术将EN02基因整合至植物基因组中，从而调节植物(优选拟南芥)的生长发育。其中，所述EN02基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
[0005]根据GenBank上公布的拟南芥基因组信息，设计用于扩增eno2基因的引物，最终克隆得到完整的基因序列。
[0006]本发明对烯醇化酶2基因在植物(拟南芥)营养生长发育和花粉发育中的功能进行了探索。
[0007]从拟南芥生物资源中心购买拟南芥烯醇化酶2基因(enolase2, eno2)的T-DNA插入突变体，经鉴定得到烯醇化酶2基因的纯合T-DNA插入突变体，并进一步通过农杆菌介导的蘸花法用eno2分别转化eno2-纯合突变体和野生型拟南芥，得到回补型和过表达型拟南芥，结合其表型分析(主要包括花粉粒显微镜观察和杂交等方法)来确定烯醇化酶2基因在拟南芥营养生长和花粉发育中的功能。结果如下:
[0008]eno2_纯合突变体的花粉粒较小，且形态异常，回补型的花粉粒大小和形态则与野生型一致。此外，θηο2--合突变体的主根长度只有野生型的1/3，它的莲座叶叶片数目只有野生型的1/2，莲座叶叶片总面积也只有野生型的1/10，地上和地下部分的重量分别只有野生型的1/2和1/3，而回补型的这些表型差异得以恢复到野生型水平。
[0009]本发明还提供利用基因工程技术将ΕΝ02基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物根的生长发育。
[0010]本发明还提供利用基因工程技术将ΕΝ02基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物叶片的生长发育。
[0011]本发明进一步提供利用基因工程技术将ΕΝ02基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物花粉粒的发育。[0012]本发明的优点在于:
[0013](一)首次证明烯醇化酶2基因在植物花粉正常发育中具有重要的功能。
[0014](二)证明了烯醇化酶2基因除了在植物耐逆中起作用，进一步证明了烯醇化酶2基因在植物正常营养生长发育中发挥着关键作用，拓展了烯醇化酶2基因的功能。【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例1中基因组水平鉴定拟南芥烯醇化酶2纯合突变体；其中，I和2为野生型拟南芥，3和4、5和6为杂合eno2_拟南芥，7-10为纯合eno2_拟南芥，11为DNA Marker。
[0016]图2为本发明实施例1中转录水平鉴定拟南芥烯醇化酶2纯合突变体。
[0017]图3为本发明实施例1中拟南芥烯醇化酶2纯合突变体鉴定原理图。
[0018]图4为本发明实施例3中生长23天的拟南芥；其中，左上角植株为纯合eno2_拟南芥，左下角植株为转pCAMBIA-1302-GFP空载体的拟南芥，中间植株为野生型拟南芥，右上角为回补eno2基因的纯合回补型拟南芥，右下角植株为过表达eno2基因的纯合过表达型拟南芥。
[0019]图5为本发明实施例3中生长28d的拟南芥的莲座叶叶片。
[0020]图6为本发明实施例3中生长15d拟南芥的主根的生长情况；其中，从左至右依次为回补型拟南芥、野生型拟南芥、纯合eno2_拟南芥、纯合回补型拟南芥和纯合过表达型拟南芥，纯合eno2_拟南芥的主根长度较短，回补型拟南芥的主根长度则恢复到了野生型的长度，过表达型拟南芥主根略长，但差异不明显。
[0021]图7为本发明实施例3中生长23d拟南芥的侧根的生长情况；其中，从左至右依次为回补型拟南芥、野生型拟南芥、纯合eno2_拟南芥回补型拟南芥和过表达型拟南芥，纯合eno2_拟南芥的侧根较少，回补型拟南芥的侧根数目则恢复到了野生型的水平。
[0022]图8为本发明实施例2中拟南芥成熟花粉粒扫描电子显微镜下观察结果；其中，从左至右依次为转空载拟南芥、野生型拟南芥、纯合eno2_拟南芥、纯合回补型拟南芥和纯合过表达型拟南芥，纯合en02_拟南芥花粉发育不正常，花粉粒较小，且形态异常，回补型拟南芥花粉粒大小和形态则恢复正常。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0024]实施例1拟南芥烯醇化酶2纯合突变体鉴定
[0025]1.1基因组水平鉴定
[0026]从拟南芥生物资源中心购买拟南芥烯醇化酶2基因(enolase2, eno2)的T-DNA插入突变体，经鉴定得到烯醇化酶2基因的纯合T-DNA插入突变体。鉴定方法如下:
[0027]针对插入序列，设计特异性引物LP和RP，位于T-DNA插入序列的两侧，BP为根据T-DNA插入序列所设计的引物(一般含有LBal、LBbl和LBbl.3)，以待测拟南芥基因组DNA为模板，分别以LP、RP和RP、BP两对引物进行PCR扩增。
[0028]其中引物LP 序列为:5’ -CCATCCAAATTTCAAACATGG-3’ ;引物 RP 序列为:5’ -CGATGATGTTGTTCACATTGC-3’。
[0029]引物BP (LBal)序列为:5’ -TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’。
[0030]PCR鉴定原理图如图3所示。
[0031]若待测植株为野生型拟南芥，则只有LP、RP引物对可以扩增出条带；若待测植株为杂合体，则两对引物均能扩增出特异性条带；若待测植株为纯合突变体，则只有RP、BP引物对可以扩增出条带。
[0032]结果如图1所示,成功鉴定出烯醇化酶2基因的纯合T-DNA插入突变体。
[0033]1.2转录水平鉴定
[0034]鉴定方法如下:
[0035]提取拟南芥叶片总RNA，反转录生成cDNA，然后以actin2为内参，并以反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR鉴定，所用的引物分别为:
[0036]eno2: sense: 5，-AATGGATGTTGCCGCTTCAGAGTTC-3’
[0037]antisense:5’ -TAAGTCAGCAATGAATGTGTCCTCG-3’
[0038]actin2: sense:5，-TAACTCTCCCGCTATGTATGTCGCC-3’
[0039]antisense:5’ -TTTCTGTGAACGATTCCTGGACCTG-3’
[0040]结果如图2所示，从图2可以看出，烯醇化酶2纯合突变体的eno2表达量明显下降。
[0041]1.3突变体中T-DNA插入位点
[0042]对RP和LBal扩增得到的片段进行测序，然后根据拟南芥基因组信息，通过生物信息学方法找到T-DNA插入的精确位点。结果见表1。
[0043]表1突变体中T-DNA插入位点
【权利要求】
1.EN02基因在植物生长发育调控中的应用，其特征在于，利用基因工程技术将EN02基因整合至植物基因组中，从而调节植物的生长发育。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述EN02基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用基因工程技术将EN02基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物根的生长发育。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用基因工程技术将EN02基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物叶片的生长发育。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用基因工程技术将EN02基因整合至拟南芥基因组中，从而促进植物花粉`粒的发育。
【文档编号】A01H5/00GK103725702SQ201310684729
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年1月31日
【发明者】张根发, 叶盼, 施子晗, 高飞, 周宜君, 李晓峰, 张永华, 程慧梅 申请人:北京师范大学