一种降低核桃外植体褐变率的培养基及培养方法与流程

本发明涉及植物组织培养领域，具体地说，涉及一种降低核桃外植体褐变率的培养基及培养方法。

背景技术：

核桃(juglansregial.)别名胡桃、羌桃，属于胡桃科核桃属植物，是一种优良的干果树种，具有极高的经济价值与营养价值。目前，核桃的无性繁殖普遍采用嫁接的方法，其繁殖系数低、速度慢，成活率不稳定且易受穗条数量限制，导致不少地区仍采用实生苗进行繁殖培育，严重限制了核桃的商业性生产；因此，利用组培快速繁殖技术，加速良种及良砧无性苗的繁育，具有很高的商业价值。

然而，核桃细胞中含有丰富的酚类物质，在组织培养过程中，酚类物质从外植体切口向外溢出，氧化产生棕褐色的醌类物质，使外植体组织变成褐色；醌类物质与外植体组织中的蛋白质发生聚合，引起酶系统的失活，从而导致外植体组织代谢活动紊乱，生长和分化停滞，最终衰老死亡；并且醌类物质扩散到培养基中也会进一步地促进外植体衰老死亡。因此，防止核桃组培外植体褐化是保证核桃组培成功关键所在，而核桃外植体的褐化程度与核桃选取的树龄，剪取枝段的部分、月份，培养基的成分，抗氧化剂的种类都有关系，所以亟待设计一种解决核桃外植体褐化问题的培养基及培养方法。

技术实现要素：

基于现有技术的不足之处，本发明提供一种降低核桃外植体褐变率的培养基及培养方法。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种降低核桃外植体褐变率的培养基，其特征在于：包括蛭石和培养液。

进一步地，所述蛭石与所述培养液的配比为：每10g蛭石中混合添加有15-25ml培养液。

进一步地，所述培养液包括以下成分：硝酸铵1.4-1.5g/l；硝酸钙1.8-2.0g/l；硝酸锌0.015-0.02g/l；硫酸钾1.5-1.7g/l；硫酸镁0.6-0.8g/l；硫酸锰0.03-0.04g/l；硫酸铜0.002-0.003g/l；氯化钙0.15-0.2g/l；磷酸二氢钾0.2-0.5g/l；硼酸0.004-0.007g/l；钼酸钠0.003-0.004g/l；乙二胺四乙酸二钠0.05-0.06g/l；硫酸亚铁0.03-0.05g/l；盐酸硫胺素0.001-0.003g/l；烟酸0.001-0.002g/l；甘氨酸0.001-0.003g/l；肌醇0.1-0.2g/l；蔗糖25-35g/l；6-苄氨基腺嘌呤0.0005-0.0015g/l；吲哚丁酸0.00001-0.00003g/l，ph5.5-6.0。

进一步地，所述培养液成分为：硝酸铵1.416g/l，硝酸钙1.968g/l，硝酸锌0.017g/l，硫酸钾1.5592g/l，硫酸镁0.74g/l，硫酸锰0.0335g/l，硫酸铜0.0025g/l，氯化钙0.18625g/l，磷酸二氢钾0.33125g/l，硼酸0.006g/l，钼酸钠0.0039g/l，乙二胺四乙酸二钠0.05675g/l，硫酸亚铁0.04225g/l，盐酸硫胺素0.0025g/l，烟酸0.00125g/l，甘氨酸0.0025g/l，肌醇0.125g/l，蔗糖30g/l，6-苄氨基腺嘌呤0.001g/l，吲哚丁酸0.00002g/l，ph5.5-6.0。

一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体培养前处理：采集核桃未木质化新梢，选取带有饱满芽的枝段，剪至3-4厘米长，进行清洗和消毒；

(2)初代培养：将蛭石倒入培养瓶中，加入培养液，盖上瓶盖，灭菌，即配制成初代培养基；将消毒后的外植体接于初代培养基中，培养12-14天；

(3)继代培养：将初代培养得到的外植体转接到所述培养液的琼脂培养基中进行继代培养。

进一步地，所述步骤(1)中清洗和消毒的具体方法为：使用1％洗洁精清洗浸泡5min，流水清洗20min；后用75％酒精消毒30s，流水清洗5-8次；再用0.1％升汞浸泡6-8min，无菌水清洗5-8次。

进一步地，所述培养液的琼脂培养基为每升所述培养液中添加6.5-7.5g琼脂制得。

有益效果：本发明提供了一种降低核桃外植体褐变率的培养基，培养基以蛭石为固态基质，具有良好的吸附性和透气性，可将外植体伤口处的酚类物质选择性地吸附、疏散，防止酚类物质在外植体切口积累；培养基将营养丰富、流动性强的培养液与蛭石以一定比例混合，在保证核桃外植体生长分化所需营养、水分的同时，进一步减轻外植体褐化的程度。

此外，本发明提供了一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，通过以蛭石为固态基质的培养基进行初代培养，降低切口褐化程度，保证外植体切口受损细胞的快速愈合；初代培养后利用培养液的琼脂培养基进行继代培养，进一步为外植体提供充足的水分和营养物质，保证外植体的快速生长分化。

综上所述，本发明培养基及培养方法防止核桃外植体褐化的效果显著，且适用于多种核桃品种，应用范围广，利于提高组培繁殖的成活率，加速良种及良砧无性苗的繁育。

附图说明

图1所示为本发明实施例1实验组培养的清香核桃外植体；

图2所示为本发明实施例1对照组培养的清香核桃外植体；

图3所示为本发明实施例1实验组与对照组褐变率统计图；

图4所示为本发明实施例1继代培养中的实验组外植体；

图5所示为本发明实施例1再次继代培养中的实验组外植体；

图6所示为本发明实施例2中不同品种核桃外植体的褐变率统计，其中，

a.清香；b.赞美；c.强特勒；d.清脆；e.辽宁1号；f.辽宁7号；g.辽宁10号；h.寒丰；i.珍珠香；j.ht1-qx；k.ht2-zm；l.ht6-l7；m.易县西陵。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步详述：

实施例1

一种降低核桃外植体褐变率的培养基，包括蛭石和培养液，每10g蛭石中混合添加有20ml培养液；培养液包括以下成分：硝酸铵1.416g/l，硝酸钙1.968g/l，硝酸锌0.017g/l，硫酸钾1.5592g/l，硫酸镁0.74g/l，硫酸锰0.0335g/l，硫酸铜0.0025g/l，氯化钙0.18625g/l，磷酸二氢钾0.33125g/l，硼酸0.006g/l，钼酸钠0.0039g/l，乙二胺四乙酸二钠0.05675g/l，硫酸亚铁0.04225g/l，盐酸硫胺素0.0025g/l，烟酸0.00125g/l，甘氨酸0.0025g/l，肌醇0.125g/l，蔗糖30g/l，6-苄氨基腺嘌呤0.001g/l，吲哚丁酸0.00002g/l，ph6.0。

常规的核桃外植体多数采用琼脂培养基进行培养，核桃外植体切口附近的细胞受到损伤，细胞内的酚类物质会在伤口处积累，氧化成醌类物质，进而逐步扩散，抑制外植体的生长和再生芽的分化；而本发明培养基采用蛭石作为培养基的固态基质，蛭石具有良好的吸附性和透气性，与流动性强的培养液混合后，可将外植体伤口处的酚类物质选择性地吸附、疏散，防止其在伤口处积累形成恶性循环。此外，培养液中无机盐、蔗糖、激素浓度以及培养液的ph均是综合了外植体正常生长分化需要和对外植体褐化的影响得到的，在保证提供充足的营养物质的同时，进一步减轻外植体褐化的程度。

一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体培养前处理

以7年生生长结果正常的清香核桃植株为实验材料，于4月初采集核桃未木质化新梢，剪至3-4厘米长；使用1％洗洁精清洗浸泡5min，流水清洗20min；后用75％酒精消毒30s，流水清洗5-8次；再用0.1％升汞浸泡6-8min，无菌水清洗5-8次。使用洗洁精、酒精、升汞对外植体茎段进行消毒，防止外植体培养过程中菌类感染。

(2)初代培养

将蛭石倒入培养瓶中，蛭石的用量以能够稳固插入外植体茎段为宜；配制培养液，用0.5m的naoh调节ph至6.0，向蛭石中加入固定量的培养液，保证培养基足够的营养以及合适的湿度、透气性；蛭石与培养液混合均匀后盖上瓶盖，121℃灭菌20min，即配制成初代培养基。将消毒后的外植体接于初代培养基中，并以dkw琼脂培养基作为对照组，实验组与对照组分别设置10个平行，25℃，光照循环：弱光(100μmol·m^-2·s^-1)16h+黑暗8h，14天后统计褐变率。

图1所示为实验组培养的清香核桃外植体，图2所示为对照组培养的清香核桃外植体，通过对比可以看出，实验组清香核桃外植体切口并未出现褐化现象，而对照组清香核桃外植体褐化严重，且向培养基中扩散。

图3所示为实验组与对照组褐变率统计图，其中，对照组平均褐变率达75％，而实验组外植体均未发生褐变，可见，本发明培养基及培养方法有效地抑制了清香核桃外植体培养过程中的褐化现象。

(3)继代培养

初代培养过程中，外植体的切口逐渐愈合，酚类物质逐渐减少，因此，将初代培养得到的外植体转接到本发明培养液的琼脂培养基中进行继代培养，25℃，光照循环：弱光(100μmol·m^-2·s^-1)16h+黑暗8h，避免强光造成酚类物质的大量产生，并且保证外植体培养过程中充足的水分和营养。待外植体腋芽萌发后，切取腋芽，转接到本发明培养液的琼脂培养基中进行再次继代培养。

培养液的琼脂培养基为每升所述培养液中添加7g琼脂制得。

图4所示为继代培养中的实验组外植体，在继代培养的琼脂培养基中，外植体并未出现褐化现象，可见，经过初代培养，已经有效避免了酚类物质对清香核桃外植体培养的影响。

图5所示为再次继代培养中的实验组外植体，转接的外植体全部成活，生长良好，且分化出饱满的新芽。

实施例2

以7年生核桃植株为实验材料，分别包括清香、赞美、强特勒、清脆、辽宁1号、寒丰、珍珠香、辽宁10号、辽宁7号9个品种以及ht1-qx、ht2-zm、ht6-l7、易县西陵4个优株。

通过实施例1中所述的培养基及培养方法对以上实验材料进行外植体培养，实验结果如图6所示。本发明培养基及培养方法对于不同品种的应用效果稍有差别，其中，应用于清香、清脆、辽宁1号、辽宁10号、ht1-qx、ht2-zm的抗褐变效果十分显著；应用于赞美、强特勒、寒丰、珍珠香、易县西陵优株的抗褐变效果良好；应用于辽宁7号的抗褐变效果一般；应用于ht6-l7的褐变率较高；综上所述，本发明应用于大多数实验品种的抗褐变效果均较为明显，实验所用的所有品种褐变率均在50％以下，由此可见，本发明培养基及培养方法可有效降低核桃外植体培养的褐变率，并且所应用的核桃品种广泛。

实施例3

一种降低核桃外植体褐变率的培养基，包括蛭石和培养液，每10g蛭石中混合添加有15ml培养液；培养液包括以下成分：硝酸铵1.4g/l；硝酸钙1.8g/l；硝酸锌0.015g/l；硫酸钾1.5g/l；硫酸镁0.6g/l；硫酸锰0.03g/l；硫酸铜0.002g/l；氯化钙0.15g/l；磷酸二氢钾0.2g/l；硼酸0.004g/l；钼酸钠0.003g/l；乙二胺四乙酸二钠0.05g/l；硫酸亚铁0.03g/l；盐酸硫胺素0.001g/l；烟酸0.001g/l；甘氨酸0.001g/l；肌醇0.1g/l；蔗糖25g/l；6-苄氨基腺嘌呤0.0005g/l；吲哚丁酸0.00001g/l，ph5.5。

一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体培养前处理：采集核桃尚未木质化新梢，选取带有饱满芽的枝段，剪至3-4厘米长，进行清洗和消毒；

(2)初代培养：将蛭石倒入培养瓶中，加入培养液，盖上瓶盖，灭菌，即配制成初代培养基；将消毒后的外植体接于初代培养基中，25℃，光照循环：弱光(100μmol·m^-2·s^-1)16h+黑暗8h，培养12天；

(3)继代培养：将初代培养得到的外植体转接到所述培养液的琼脂培养基中，25℃，光照循环：弱光(100μmol·m^-2·s^-1)16h+黑暗8h，进行继代培养，待外植体腋芽萌发后，切取腋芽，转接到本发明培养液的琼脂培养基中进行再次继代培养。培养液的琼脂培养基为每升所述培养液中添加6.5g琼脂制得。

实施例4

一种降低核桃外植体褐变率的培养基，包括蛭石和培养液，每10g蛭石中混合添加有25ml培养液；培养液包括以下成分：硝酸铵1.5g/l；硝酸钙2.0g/l；硝酸锌0.02g/l；硫酸钾1.7g/l；硫酸镁0.8g/l；硫酸锰0.04g/l；硫酸铜0.003g/l；氯化钙0.2g/l；磷酸二氢钾0.5g/l；硼酸0.007g/l；钼酸钠0.004g/l；乙二胺四乙酸二钠0.06g/l；硫酸亚铁0.05g/l；盐酸硫胺素0.003g/l；烟酸0.002g/l；甘氨酸0.003g/l；肌醇0.2g/l；蔗糖35g/l；6-苄氨基腺嘌呤0.0015g/l；吲哚丁酸0.00003g/l，ph5.8。

一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体培养前处理：采集核桃尚未木质化新梢，选取带有饱满芽的枝段，剪至3-4厘米长，进行清洗和消毒；

(2)初代培养：将蛭石倒入培养瓶中，加入培养液，盖上瓶盖，灭菌，即配制成初代培养基；将消毒后的外植体接于初代培养基中，25℃，光照循环：弱光(100μmol·m^-2·s^-1)16h+黑暗8h，培养13天；

(3)继代培养：将初代培养得到的外植体转接到所述培养液的琼脂培养基中，25℃，光照循环：弱光(100μmol·m^-2·s^-1)16h+黑暗8h，进行继代培养，待外植体腋芽萌发后，切取腋芽，转接到本发明培养液的琼脂培养基中进行再次继代培养。培养液的琼脂培养基为每升所述培养液中添加7.5g琼脂制得。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。