一种培养羊膜上皮细胞的组合培养基的制作方法

本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种培养羊膜上皮细胞的组合培养基。

背景技术：

羊膜位于胎儿绒毛膜的表面，为光滑、无血管、无神经、无淋巴的透明薄膜，厚约0.02～0.50mm，由羊膜上皮细胞、基底膜和基质组成。形成于原肠胚之前的受精第8天，羊膜组织细胞保持有前原肠胚胚胎细胞的可塑性，羊膜组织主要由来源于外胚层的羊膜上皮(amnioticepithelialcells，aecs)和来源于中胚层的羊膜间充质(amnioticmesenchymecells，amcs)两类细胞组成，羊膜上皮细胞具有三种胚原基层细胞的分化潜能。

神经发育生物学研究认为神经发生早期，羊膜组织直接与神经上皮联系,向羊水中释放神经递质及神经营养因子，在神经系统发育过程中起着重要作用。由于羊膜组织是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，aecs表面人类白细胞抗原dr遗传座位(humanleucocyteantigen-dr，hla-dr)低表达，不表达hla-a，b，c抗原，此外，羊膜组织系产后废弃物无伦理学问题；羊膜组织细胞来源充分，具有神经细胞的神经生物学特点和功能，利用上述优势使羊膜组织细胞有望成为再生医学领域的可靠细胞来源，开展细胞移植治疗神经系统退行性疾病和外伤性神经损伤。

但是由于羊膜上皮细胞在培养过程中难以维持其干细胞特性，一方面容易分化形成成熟上皮细胞，失去其干细胞特性；另一方面容易产生上皮—间质转化，失去其上皮细胞特性。难以应用于再生医学中。

羊膜上皮细胞要应用于再生医学，首先需要解决的问题是如何在保持其上皮细胞特性的同时维持其增殖能力。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种培养羊膜上皮细胞的组合培养基。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种培养羊膜上皮细胞的组合培养基，包括如下组分：

eplife培养基+1％hkgs+羊膜匀浆上清；

所述的羊膜匀浆上清中的蛋白在组合培养基中的浓度为2～8ng/ml，优选为4ng/ml。

所述的羊膜匀浆上清的制备方法，包括如下步骤：

(1)羊膜经过0.25％胰酶消化，完全去除其上附着的羊膜上皮细胞，灭菌注射用水彻底清洗；

(2)将清洗好的羊膜剪碎，完全冻干水分；

(3)将液氮和冻干的羊膜倒入研钵，反复研磨直至液氮挥发；

(4)加入少量基础培养基dmem/f12，混匀；

(5)超声破碎，循环30次；

(6)0.22μm滤膜过滤，取滤液，即为羊膜匀浆上清。

步骤(1)中所述的消化的时间优选为2h。

步骤(1)中所述的超声破碎的条件为ф＝6，超声时间3s，间隔时间3s。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明的组合培养基是将消化去细胞的羊膜经过冷冻干燥、液氮研磨、超声破碎，过滤除菌得到羊膜匀浆上清，将该匀浆上清以一定比例加入特定培养基中。该培养基可以在维持羊膜上皮细胞特性的同时有效提高羊膜上皮细胞增殖能力，延长羊膜上皮细胞的有效培养代数。

附图说明

图1是实施例1中p1代羊膜上皮细胞形态。

图2是实施例1中p1代羊膜上皮cd29流式表型检测。

图3是实施例1中p1代ck19免疫组化。

图4是实施例1中p6代羊膜上皮细胞形态。

图5是实施例1中p6代ck19免疫组化。

图6是实施例1中testp8细胞形态及免疫组化；其中，a：testp8细胞形态；b：testp8免疫组化。

图7是实施例2中p6代两组羊膜上皮细胞形态。

图8是实施例2中p6代两组羊膜上皮细胞ck19免疫组化。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一、材料与方法

1.材料及仪器

(1)材料：羊膜标本取自健康产妇孕婴。经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、torch检测、支原体、衣原体、g-6pd和地贫等均阴性。标本采集后运回血库过程保持4～8℃运输条件。

(2)仪器设备

培养箱：日本三洋，型号mco-20aic

超净台：苏净安泰空气技术有限公司，型号sw-cj-2fd。

显微镜：olympus，型号ckx41-f32fl。

离心机：thermo，型号heraeusmultifugex3。

(3)耗材：

eplife基础培养基gibico公司2～8℃

hkgs添加物gibico公司-20℃

胰酶gibico公司2～8℃。

2.羊膜上皮细胞的制备

从健康人的羊膜组织中提取羊膜上皮细胞，获取的羊膜上皮细胞进行体外培养、扩增。

1)无菌采取健康人的胎盘，将羊膜与胎盘绒毛组织分离，无菌生理盐水清洗羊膜；

2)0.01％胰酶37℃消化10分钟，弃去消化物，无菌生理盐水清洗羊膜；

3)0.1％胰酶37℃消化10分钟，收集消化物并用血清终止消化，无菌生理盐水清洗羊膜，收集洗液，混合消化物和洗液。

4)800g，10min离心，收集细胞。

3.羊膜匀浆上清制备

(1)羊膜经过0.25％胰酶消化2小时，完全去除其上附着的羊膜上皮细胞，灭菌注射用水彻底清洗。

(2)将清洗好的羊膜剪碎，冷冻干燥仪中完全冻干水分。

(3)将液氮和冻干的羊膜倒入研钵，反复研磨直至液氮挥发。

(4)加入少量基础培养基dmem/f12，混匀。

(5)超声破碎，ф＝6，超声时间3s，间隔时间3s，循环30次。

(6)0.22μm滤膜过滤。

(7)检测蛋白浓度，加入少量基础培养基eplife培养基调整蛋白浓度至40ng/ml，4℃保存。

4.细胞培养

细胞平均分为两组test与control，test加入培养基eplife+1％(v/v)hkgs+羊膜匀浆上清，培养基中羊膜匀浆上清蛋白终浓度为4ng/ml；control为eplife+1％(v/v)hkgs，调整细胞密度至1×10⁴/ml，2ml/t25培养瓶培养。

5.羊膜上皮细胞的鉴定

羊膜上皮细胞的鉴定通过以下方法：羊膜上皮细胞形态学分析，ck19免疫组化，cd19流式表型鉴定。

二、结果与分析：

倒置显微镜下观察p1代羊膜上皮细胞形态较单一，铺路石样生长(见图1)。经流式细胞仪检测显示，细胞表面抗原cd29、阳性表达率达到95％以上(见图2)，ck19免疫组化显示胞质与胞膜染色阳性(见图3)，证明所获得的细胞为羊膜上皮细胞。

6.传代培养

细胞平均分为两组test与control，test加入培养基eplife+1％(v/v)hkgs+羊膜匀浆上清，培养基中羊膜匀浆上清蛋白终浓度为4ng/ml；control为eplife+1％(v/v)hkgs，调整细胞密度至1×10⁴/ml，2ml/t25培养瓶培养。细胞80％融合后传代。

7.传代培养结果

control组p6代细胞老化严重，p7代时细胞已经无法继续贴壁生长(见图4)。

test组p8代细胞老化，p9代时细胞已经无法继续贴壁生长(见图5)。

可见test组较control组维持更长时间增殖能力，并在增殖期间，维持了其上皮细胞特性(图6)。

实施例2

羊膜标本取自健康产妇孕婴。经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、torch检测、支原体、衣原体、g-6pd和地贫等均阴性。标本采集后运回血库过程保持4～8℃运输条件。按照以下方法处理。

1.羊膜上皮细胞的制备

从健康人的羊膜组织中提取羊膜上皮细胞，获取的羊膜上皮细胞进行体外培养、扩增。

1)无菌采取健康人的胎盘，将羊膜与胎盘绒毛组织分离，无菌生理盐水清洗羊膜；

2)0.01％胰酶37℃消化10分钟，弃去消化物，无菌生理盐水清洗羊膜；

3)0.1％胰酶37℃消化10分钟，收集消化物并用血清终止消化，无菌生理盐水清洗羊膜，收集洗液，混合消化物和洗液。

4)800g，10min离心，收集细胞。

2.羊膜匀浆上清制备

(1)羊膜经过0.25％胰酶消化2小时，完全去除其上附着的羊膜上皮细胞，灭菌注射用水彻底清洗。

(2)将清洗好的羊膜剪碎，冷冻干燥仪中完全冻干水分。

(3)将液氮和冻干的羊膜倒入研钵，反复研磨直至液氮挥发。

(4)加入少量基础培养基dmem/f12，混匀。

(5)超声破碎，ф＝6，超声时间3s，间隔时间3s，循环30次。

(6)0.22μm滤膜过滤。

(7)检测蛋白浓度，加入少量基础培养基eplife培养基调整蛋白浓度至40ng/ml。

p2代细胞鉴定同实施例1

3.细胞平均分为两组test与control，test加入培养基eplife+1％(v/v)hkgs+羊膜匀浆上清，培养基中羊膜匀浆上清蛋白终浓度为4ng/ml；control为基础培养基dmem+10％(v/v)胎牛血清，调整细胞密度至1×10⁴/ml，2ml/t25培养瓶培养。

4.羊膜上皮细胞的鉴定

1)羊膜上皮细胞的鉴定通过以下方法

p6代后ck19免疫组化鉴定。

2)细胞鉴定结果：

control表现明显的间充质样形态，细胞细长(见图7)，免疫组化ck19染色为阴性(见图8)。

test铺路石样生长，细胞小且呈多边形(见图7)，免疫组化ck19染色为阳性(见图8)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。