专利名称：穿刺芽孢杆菌菌剂及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种纯孢子生物制品。
穿刺芽孢杆菌(Bacilluspenetrans)的孢子能附着在根结线虫(MeloidogyneSpp.)等多种植物线虫身上，使幼虫不活泼，雌虫不产卵，因此它是对有害线虫进行生物防治的一种有希望的研究对象。美国Mankau等以被孢子感染的土壤作为该菌的来源，但这种材料不便于运输和保存。澳大利亚Stirling等先后用温室盆栽番茄接种和浅盘与马铃薯块茎的方法取根干燥粉碎，虽有所改进，但效价仍不高，而且可能携带其他病原。
本发明的目的旨在提供一种能防治经济作物寄生线虫的穿刺芽孢杆菌菌剂(纯孢子制剂)及其制造方法。
穿刺芽孢杆菌菌剂的制造方法是先用穿刺芽孢杆菌感染根结线虫幼虫，再用根结线虫阳性幼虫接种易感植物，将接种过根结线虫阳性幼虫的易感植物的阳性根系洗净后剪成小段再加水打浆，通过铜筛，在流下的液体中加10倍以上清水，再过滤，滤出液在4～15℃下静置，将沉淀物在4～10℃下风干，研末即为穿刺芽孢杆菌菌剂(纯孢子制剂)。
施用本发明所述的穿剌芽孢杆菌菌剂后可有效地降低根结线虫、短体线虫等多种植物线虫的虫口密度，从而减少因线虫寄生造成的产量损失，特别是对易感作物的幼苗阶段具有明显的保护作用(因为苗期一旦受线虫感染很容易死亡)。适于在香蕉、柑桔、茶苗、烟草、番茄、辣椒、桃、猕猴桃、罗汉果、葡萄、丝瓜、南瓜和葫芦等数十种经济作物上施用(包括花卉、药材、林木)，在温室和塑料大棚内施用效果更著。由于在提纯孢子的过程中，多次大量加水，实际上起到洗涤作用，所以该菌剂携带其他病原的机会大大减少。本制剂纯系生物制品，无毒性，不污染环境，如获推广，不但使作物增产，而且可以减少化学杀线虫药进口，提高农产品的出口竞争力。
实施例将含有大量幼虫的水液在4～15℃下静置12小时后，吸去上清液，沉下的幼虫倾入50～100ml小烧杯内，加入已收集的穿剌芽孢杆菌，放在25℃生化培养箱内，每天振荡3次，充气3次，每次充气30分钟，2～3天后用小吸管吸取一滴放在载玻片上检查，随机观察10只幼虫，如果每只幼虫身上都有5个以上可见孢子，则此批幼虫可供接种之用。
接着用根结线虫阳性幼虫接种易感植物，将上述阳性幼虫稀释成一定体积，抽取小量在解剖镜下计数，以确定幼虫的密度，然后按“幼虫数＝密度×体积”的公式计算5000～10000只幼虫该取多少体积的稀释液。在幼苗定植后1-2周，拔开茎基部周围的表土，用移液管吸取该体积的稀释液滴入该处，即每株接种5000～10000只，然后复土。温暖的季节经2个月，寒冷的季节经4个月后即可收获根系。除番茄外，还筛选出土牛膝(AchyranthesasperaL.)、吊灯花(Hibiscusschizopetalus(Masters)Hook.f.)莙达菜(Betavulgarisvar.ciclaL.)、烟草(NicotianatabacumL.)等易感植物均可供接种。这4种植物不但与番茄一样适于接种，而且具有以下优点土牛膝为野生植物，不占用耕地;吊灯花为观赏树木，也不占地，且根系庞大;莙达菜为冬季作物，可维持根结线虫周年生长;烟草抗逆性比番茄强，当番茄不易生长时可取而代之。因此，恰当地利用这4种植物进行体内培养，能更有效地进行穿剌芽孢杆菌的生产，具有实用性。
在上述根系中随机抽样，剖出10只以上雌虫，若70%以上的雌虫体内有孢子，则可供制取。把所有的阳性根系洗净后剪成1.5～2.5cm的小段，投入组织匀浆机内，加水至淹没为止，以10000转/分打浆3次，每次1分钟，间歇3分钟。然后将此匀浆顺次通过20目和60目铜筛，流下的液体加10倍以上清水，再用致密的的确良布铺在大漏斗上过滤，滤出液装入大容量的圆柱形玻璃容器内，于5～15℃下静置过夜，第二天吸去上清液后再加入清水，如此反复沉淀3次。最后把容器底部的沉淀物于5～10℃下风干，研成粉末，此粉末内含有穿剌芽孢杆菌的无数孢子，即纯孢子制剂。经用血球计数板测定，每克制剂含孢子2×1010个以上。下一次感染幼虫时即可用这种制剂。
使用方法最好在幼虫定植时施用，按每株0.1克(约含10亿个孢子)称取该菌剂，用100倍细砂混合或用100倍清水调匀，与幼苗的根部一起埋在穴内。如果已经错过定植时间，可用更多的水将该菌剂调匀，浇在根周土壤中。
为了获得穿剌芽孢杆菌，可采用如下分离方法从野外采集根结线虫易感植物的根部虫瘿，洗净，在解剖镜下一只一只地剖出根结线虫雌虫，分别放在载玻片上，加一小滴蒸馏水，逐个挑破，在显微镜下逐一检查，仔细寻找穿剌芽孢杆菌。该菌的孢子形状象安全帽，直径为3.6～4.1(平均4.1)μm，高度2.1-2.1(2.1)μm[根据30个孢子测量]，其中央有高度折光的内生孢子。一俟发现这种孢子，即把整只雌虫连同其所绽出的内脏团收集在一个50-100ml的小烧杯内，5-10℃下保存备用。
为了获得根结线虫大量幼虫可从野外易感根结线虫的植物中大量采集阳性株的根系，洗净后剪成2-4cm的小段，装入一个柱形小金属桶内，加清水至半桶并搅拌3次，每次2～3分钟。然后分批捞出根段，剩下的水倾入铜筛，大量卵块会留筛上。将筛放在漏斗上，漏斗下连着一段乳胶管，用弹簧止水夹夹住。周围温度保持在25-28℃。定时用喷雾器往铜筛上喷水雾，每4小时一次，以筛网下沥出水流为度，保持卵块潮湿。每12小时打开止水夹，收集乳胶管内的水液，水液里含有大量幼虫。
权利要求
1.穿刺芽孢杆菌菌剂的制造方法，其特征在于先用穿刺芽孢杆菌感染根结线虫幼虫；再用根结线虫阳性幼虫接种易感植物；将接种过根结线虫阳性幼虫的易感植物的阳性根系洗净后剪成小段再加入打浆，通过铜筛，在流下的液体中加10倍以上清水，取其滤出液在4～15℃下静置，将沉淀物在4～10℃下风干并研末即可。
2.穿刺芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是接种过受穿刺芽孢杆菌感染的根结线虫阳性幼虫的易感植物阳性根系，经加水打浆，通过铜筛后加清水，过滤，在4～10℃下静置、风干、研末所得的粉末。
全文摘要
本发明提供一种能防治经济作物寄生线虫的穿刺芽孢杆菌菌剂及其制造方法。它先用穿刺芽孢杆菌感染根结线虫幼虫，再用根结线虫阳性幼虫接种易感植物，将接种过根结线虫阳性幼虫的易感植物的阳性根系加水打浆，经铜筛流下的液体加清水、过滤、静置、风干、研末即可。施用后可有效地降低根结线虫，短体线虫等虫口密度，减少产量损失，特别对易感作物的幼苗阶段具有明显的保护作用，适于多种经济作物施用，无毒性。
文档编号A01N63/00GK1086663SQ9211295
公开日1994年5月18日 申请日期1992年11月7日 优先权日1992年11月7日
发明者潘沧桑, 林竞 申请人:厦门大学