专利名称：高纯度低聚木糖的酶法制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及用麸皮、蔗渣或玉米芯为原料，碱法制备的精制木聚糖作底物，用假单胞菌Pseudomonas sp.XUN024CGMCCNo.0458发酵生产的木聚糖酶，进行酶转化制造低聚木糖的方法。
低聚木糖(Xylooligosaccharide)是功能性低聚糖中的一种。所谓低聚糖，又称寡糖(oligosaccharide)，它是由2-10个单糖分子通过糖苷键构成的聚合物。近20年来功能性低聚糖的研究开发及其产业化发展迅猛，这一类产品作为双歧杆菌生长促进因子而广泛应用于食品和饲料生产中。已工业化的功能性低聚糖有十多种。亚洲除日本外，韩国和我国，包括台湾省也已有一些功能性低聚糖品种生产。欧洲国家对此研究很活跃，美国企业界近年对低聚糖也表示出很大兴趣。美国在阿斯巴甜配制的低热量饮料中，配以功能性低聚糖，以改善饮料的口感，并增加双歧菌的增殖效果。
低聚木糖以其优异的特性口感好类似于蔗糖、酸稳定性和热稳定性好、黏度低、降低水分活度、防止冻结等，而有利于食品工业加工；非消化性、整肠功能显著、服用量少(每人每日0.7g)等，使能在众多低聚糖产品中占有重要地位。尤其是对双歧杆菌增殖效果，优于其他功能性低聚糖。人体口服试验证明，每日摄入量0.7g，大肠中双歧菌比例从摄入前8.5％，两周后增加到17.9％，三周后增加到26.2％。与此对照，达到相当的双歧菌增殖比例所需低聚异麦芽糖或低聚果糖的每日摄入量为10-15g，和7-8g。因此它在目前日本低聚糖市场上价格最高，是低聚异麦芽糖16倍，低聚果糖的6倍。
日本市场的低聚木糖产品有三种规格木寡糖70(液体，含低聚木糖70％，其他糖类30％，价格2500日元/公斤)；木寡糖35(粉末，含低聚木糖35％，其他糖类65％)；木寡糖20(粉末，含低聚木糖20％，其他糖类80％)。产品作为食品配料应用于乳酸饮料，巧克力和黑醋调味料等制成品的生产。
低聚木糖的制备方法有以下几种1.化学方法降解，如用酸水解法(Mitsuish Y.；Agric.Biol.Chem，1988，52921-927)；2.物理方法降解，如热水抽提(JP62281890A2)包括蒸汽压力渗透法(JP6197800A2)、微波法(JP1224384A2)等；3.生物降解法或酶法，酶法制备主要是利用微生物的木聚糖酶系，酶解植物原料中的半纤维素即木聚糖，得到以木二糖、木三糖为主成分的低聚木糖产物。
物理、化学方法降解速度难以控制，或精制工艺繁琐，得率低，不适合工业化生产。酶法制备是研究最多，也是更为实用的方法。酶法制备的关键是高活力、且具有合理酶系的木聚糖酶。
早期的木聚糖酶研究主要是用于饲料、造纸、纺织助剂等。国内外研究报道能产木聚糖酶的微生物有黑曲霉、海枣曲霉、里氏木霉、绿色木霉、球毛壳霉、微紫青霉、宛氏拟青霉、顶青霉、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单孢菌等。
木聚糖酶是一类复合酶系，主要包含内切-β-木聚糖酶，端切木聚糖酶，β-木糖苷酶等。不同来源的酶系组分有所不同。当用于制备低聚木糖时，则希望酶解产物中不含或少含单糖(木糖)。希望得到仅从内部切β-1.4糖苷键的内切酶，得到酶解产物木二糖、木三糖，而希望没有或减少从一端切β-1.4键的端切酶和水解木二糖、木三糖的木糖苷酶。早期的木聚糖酶研究注重其酶活，希望酶解彻底，而不注重酶系。目前研究或报道的菌株所产的木聚糖酶，用于酶解木聚糖时都还产生较高的木糖、葡萄糖等组分。
入江利夫等的日本专利特开昭62-155095和JP02119790A2，报道了木聚糖分解物的制造方法和木二糖的制造方法。他们对得到以木二糖为主的木聚糖酶生产菌株的筛选作了大量工作。最终筛选了球毛壳霉(Chaetomiumgracil)菌株生产木聚糖酶，诱变后的菌株(Chaetomium gracil 1161固态发酵的酶活达到2,600U/g培养基，酶液用于水解木聚糖(桦木)所得产物中低聚木糖与木糖之比从诱变前的34∶66提高到72∶21。该项技术被用于低聚木糖的工业化生产，由新日本化学株式会社生产木聚糖酶，三得利公司生产低聚木糖产品。
其他关于低聚木糖的研究如野口(NOGUCHI NORITAKA，JP06261750A2，JP10215866A2)等用芽孢杆菌Bacillus sp.生产的木聚糖酶制备低聚木糖。荒木(ARAKI TOSHIYOSHI，JP10295372A2)等用产碱杆菌(Alcaligenes)生产的β-1，3-木聚糖酶，它水解水聚糖的β-1，3键，而不作用木二糖β-1，4键，因而得到产物主要是木二到木六糖的低聚木糖。法国Patrice Pellerin等(Enzymic production of oligosaccharides from corncob xylan，Enzyme.Microb.Technol.，13617-621，1991)用梭状芽孢杆菌(Clostridium)的木聚糖酶从玉米芯制备低聚木糖。其他国家的研究较少。
国内1997年蔡静平等(微生物学通报，2491-94，1997)报道了真菌分解玉米芯生产低聚木糖的研究。最近还有一些研究者陆续报道了他们用黑曲霉、里氏木霉、顶青霉等真菌产生的木聚糖酶从玉米芯等的木聚糖来制备低聚木糖的研究。
本发明的目的是提供一种工艺简单的酶转化木聚糖制备低聚木糖的方法。所得到的酶转化产物中低聚木糖含量达到90％以上，木糖、葡萄糖等单糖组分在10％以下。
本发明通过下列方案来实现(1)以本实验室筛选并保藏的耐碱性木聚糖酶产生菌假单胞菌属Pseudomonas sp.XY-11，为出发菌，经过紫外线和亚硝基胍诱变获得变异菌株假单胞菌(Psudomonas sp.)XUN024-CGMCCNo.0458，作为产酶菌株；(2)菌株经斜面活化，发酵产酶，制备液体或固体酶制剂，作为酶源；(3)以麸皮、蔗渣或玉米芯为原料，碱法制备木聚糖，精制后作为酶转化底物；(4)酶转化生成低聚木糖，经脱色、脱盐、浓缩，制成低聚木糖糖浆，或干燥成低聚木糖粉末。
菌种及其诱变从某造纸厂废水沟取样，经不断的分离纯化及筛选，获得一株产木聚糖酶细菌XY-11，该菌株产酶稳定，酶活在产酶基础培养基上摇瓶发酵36h酶活可达170U/ml。以该菌作为出发菌株。
菌种初步鉴定结果电镜观察该菌为革兰氏染色阴性，短杆状，细胞单个，无芽孢，无鞭毛。
在葡萄糖培养基上，此菌形成中间微凸的光滑的圆菌落，呈乳黄色，奶油状，生长2天菌落直径为1-1.5mm。在肉汤平板上，此菌为四周有环状皱褶，中间微凹，菌落灰白略黄色，生长2天菌落直径为2-3mm。
琼脂穿刺培养生长缓慢，成直线，不扩散。肉汤琼脂斜面上划直线培养，菌苔呈丝状，不向两侧扩散。肉汤表面培养时形成浮膜状的菌膜，并产碱。
该菌严格好氧，在以简单的有机化合物作为唯一的碳源和能源的无机培养基中就可以生长，能利用乙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和葡萄糖等碳源，硝酸盐能作为氮源，该菌的生长温度范围较广，在4-48℃之间可生长。在PH4.5C以下不生长，在PH9.4的条件下生长良好。部分生理生化特性研究结果见表1.1。
根据XY-11菌株的初步鉴定结果，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》和相关的一些细菌鉴定文献，比较了其中对G-、杆状细菌的描述(特别是对有无鞭毛及氧化酶实验)，我们初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.XY-11)。
表1.1 XY-11的部分生理生化特性
用Pseudomonas sp.XY-11为亲株，按常规方法进行紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变处理。紫外线照射时间为60s(致死率为83％)，从选择性平板上挑取透明圈较大的若干株菌，采用基础产酶培养基进行摇瓶复筛，其中产酶较高的第15号菌株命名为XUV015，比出发菌株的酶活高出50％左右(酶活250U/ml)，再采用NTG进行诱变，作用时间为30min的剂量(致死率为86％)进行诱变，从选择性平板上挑取数十株透明圈较大的菌进行摇瓶复筛，筛选到一株酶活很高的菌株24号，其酶活较XUV015提高约42％，达到354U/ml，命名为XUN024。该菌株已于2000年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.0458。
产酶菌株的培养和发酵斜面培养配制含葡萄糖1-10％，蛋白胨0.5-5％，NaCl0.5-5％，琼脂2-2.5％，其余为水，PH6-9的培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。100-120℃灭菌，20-50分钟，灭菌后冷却、接种上面获得的XUN024菌株，20-40℃培养10-40小时。
产酶培养配制含麸皮1-6％，(NH4)2SO40.4-1％，K2HPO40.2-1％，其余为水，PH6-9的培养基，装液量20-100ml/250ml三角瓶，100-120℃灭菌，20-50分钟，灭菌后冷却、接种斜面培养物，接种量5-10％，20-40℃，旋转式摇瓶柜转速100-220r/m。XUN024在上述条件下进行摇瓶发酵试验，24-36h产酶可达600U/ml以上。
木聚糖酶活测定方法参照文献Bailey et al.J.Biotechnol，1992，23257-270。巴比妥纳缓冲液稀释适当倍数后，依次加入0.5ml稀释酶液，1ml、1％的标准木聚糖悬浮液，50℃水浴保温30min，立即加入DNS试剂1ml，沸水浴5min，冰水浴冷却，定容至25ml，于540nm处比色测OD值(以木糖为标准)。酶活定义为上述条件下，每分钟释放1μmol的还原糖量(以木糖计)的酶量为1个酶活单位(U)。
在以上酶活力单位计算时，是以每分钟所产生的木糖量计算的，但木聚糖酶水解木聚糖的产物一般为木二糖、木三糖及更高聚合度的低聚木糖，而没有或很少木糖，因此以木糖量计算可能会有一定的误差。分别测定木糖、木二糖还原糖标准曲线，加以对照并比较O.D值与微摩尔量之间的关系，发现两者相差很小。说明在计算酶活力时，以木糖量来代替木二糖或木三糖量来计算是合理的，而且由于文献上都是以木糖量来计算酶活力单位，也便于对比。
木聚糖制备参考文献(J.D.Breccia et al.J.Appl.Bacteriol.1995，78469-472)的方法，用碱法提取麸皮、蔗渣或玉米芯原料中的半纤维素即木聚糖，精制后用作酶转化底物。
甘蔗渣粉(过40目筛)用0.1-2mol/l的NaOH溶液溶解，0-0.2Mpa的压力下蒸煮0.5-3小时，过滤。滤液用乙醇沉淀，20000×g离心倾去上清液，沉淀用0.1-2mol/l的NaClOa沸水浴溶解。于20000×g离心倾去上清液，收集的沉淀用乙醇溶解。此操作再重复两次，得到的沉淀，于烘干4-36小时，得到木聚糖。
得到木聚糖在酶解前应进行精制处理，目的是为了除去木聚糖提取液中可能影响木聚糖酶作用的杂质，并有利于酶解液中低聚木糖产物的提取、纯化，可保证产品的质量。
酶转化反应以木聚糖为底物，底物浓度为1-2.0％，加酶量为100-500U/g底物，反应温度为30-40℃，酶解时间为10-30小时。在此条件下所得的木聚糖酶解液进行薄层层析色谱分析表明，酶解液中主要成分为木二糖及木三糖。
低聚木糖提取精制酶解后所得的低聚木糖酶解液主要成分为木二糖及木三糖，还有未转化的木聚糖，还含有较高的无机盐杂质及较深的颜色，必须对其进行分离、提取并进行脱盐和脱色处理来加以精制，从而得到高纯度、高质量的低聚木糖产品。
采用超滤方法分离未转化的大分子木聚糖，采用活性炭、717#强阴离子交换树脂、732#强阳离子交换树脂进行脱盐脱色处理，这样，能达到较好的精制效果和低聚木糖得率。
木聚糖酶解液组分及含量的测定采用HPLC(高压液相色谱)方法，色谱仪Waters 510型，色谱柱Spherisorb氨基柱，检测器Waters 2410，温度30℃，流动相66.6％(V/V)乙腈/水溶液，流动相流速1.0ml/min。
或采用快速层析柱方法，即加压柱层析技术。洗脱剂为正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶1可以满足对Rf值的要求。装柱方法取适量的薄层层析硅胶(G60)于研钵中，加入洗脱剂，适当研磨后，缓慢加入层析柱中。在柱的底部及硅胶表面均匀铺上一薄层石英沙。进样及收集以少量的洗脱剂溶解干燥过的样品，用滴管小心加入层析柱中，加入洗脱剂，加压，打开下部活塞，以每管5ml收集洗脱液。
分析与测定将收集的洗脱液，每隔一管取样，点样于薄层层析硅胶板上，于层析缸中以上行法层析后，显色。与原木聚糖酶解液薄层层析色谱图比较，将同一组分的各管合并，真空浓缩，即得到所需组分的样品。
图1为菌株XY-11的选育谱系；图2为本发明工艺流程示意图；本发明克服了物理、化学方法降解速度难以控制，或精制工艺繁琐，得率低，不适合工业化生产的缺点。本发明的优点是选育了一株高酶活、主要包含内切-β-木聚糖酶的假单胞菌Pseudomonas sp.XUN024-CGMCCNo.0458，提供了一种工艺简单的酶转化木聚糖制备低聚木糖的方法。所得到的酶转化产物中低聚木糖含量达到90％以上，木糖、葡萄糖等单糖组分在10％以下，并由此得到高纯度的低聚木糖产品。
下面的实施例对本发明作详细说明。
实施例1木聚糖酶的制备斜面培养培养基为葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，PH8.5，110℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为假单胞菌Pseudomonassp.XUN024-CGMCCNo.0458，37℃培养17小时，作为斜面活化种子。
种子培养培养基为葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，PH8.5，装液量20ml/250ml，110℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子1环，37℃培养17小时，作为液体种子。
产酶培养培养基为麸皮6％，(NH4)2SO40.4％，K2HPO40.2％，pH8.5，装液量20ml/250ml，110℃灭菌，20分钟，灭菌后冷却、接种种子液，接种量5％，37℃，旋转式摇瓶柜转速220r/m。XUN024在上述条件下进行摇瓶发酵试验，36h产木聚糖酶酶活为825U/ml。
实施例2麸皮木聚糖酶解麸皮预处理麸皮过60目筛后，按液料比V/W为4∶1加水，每克麸皮加10单位耐高温α-淀粉，95℃水解，再以热水洗涤麸皮两次，过滤，去除淀粉及一部分可溶性蛋白质。
碱提取100克预处理后麸皮，加入NaOH溶液，碱浓度为5％，液料比(V/W)为5∶1，温度为40℃，静止浸泡，时间为4小时，碱提后，离心，离心后残渣以蒸馏水洗涤离心两次，合并上清液，经6.0mol/L盐酸中和后，以两倍工业酒精加以沉淀，放置过夜，离心，在这一条件下，木聚糖提取率为33.75％。(烘干至恒重，计算木聚糖提取得率)。
木聚糖酶解用碱提麸皮木聚糖，用水配制浓度为2.0％底物；加按实例1方法制备的木聚糖酶，加酶量为350U/g木聚糖；反应温度为37℃，酶解时间为24小时。在此条件下所得的木聚糖酶解液进行薄层层析色谱分析表明，酶解液中主要成分为木二糖及木三糖，未检出木糖、葡萄糖。用快速层析柱分析所得酶解液干燥物，其低聚木糖组分中，木二糖含量为30.45％，木三糖含量为36.32％，低聚木糖占总干燥物的含量为60.94％。
实施例3蔗渣木聚糖酶解按实施例2的方法，用碱提蔗渣木聚糖100g(干物质计)，配制浓度为2.0％的木聚糖水悬液，加按实例1方法制备的木聚糖酶，按实施例2的方法酶解。所得的酶解液进行超滤(膜分子量5000)，滤液用活性炭脱色，717#、732#树脂脱盐处理，再于50℃，-0.09MPa，真空浓缩，得到低聚木糖糖浆34.2g(干糖浆重)，对木聚糖总收率为34.2％。HPLC分析表明，所得低聚木糖组分木二糖44.7％，木三糖48.2％，低聚木糖含量为92.9％。
权利要求
1.一种高产木聚糖酸的菌株，它是假单胞菌(Pseudomonas sp.)XUN024CGMCC No.0458。
2.一种制备本聚糖酶的方法，包括将权利要求1所述的菌株经斜面活化，种子培养，发酵得木聚糖酶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵条件为温度20-40℃，转速100-220r/m。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵墙养基为麸皮1-6％，(NH4)2SO4/0.4-1％，K2HPO40.2-1％，其余为水，PH6-9，各组分的含量均为重量体积百分比。
5.制造低聚木糖的方法，包括(1)以麸皮、蔗渣或玉米芯为原料，用碱法提取木聚糖，精制；(2)以(1)的产物为底物，加权利要求2得到的酶液，反应温度30-40℃，酶解时间10-30小时；(3)采用超滤方法分离未转化的大分子木聚糖，采用活性炭，717#强阴离子交换树脂脱盐，超滤或真空浓缩，制成低聚木糖糖浆，或真空干燥制成低聚木糖粉末。
6.根据权利要求5所述的方法，其中(2)所述的加酶量为100-500U/克底物。
全文摘要
本发明涉及酶转化制造低聚木糖的方法,其特征是本实验室筛选并保藏的耐碱性木聚糖酶产生菌假单胞菌Pseudomonas sp.XY－11为亲株,按常规方法进行紫外线和亚硝基胍诱变处理,得到的突变株假单胞菌Pseudomonassp.XUN024(即CGMCCNo.0458),在优化条件下发酵产酶酶活达到800－1000U/ml;酶制剂用于麸皮、蔗渣或玉米芯为原料,碱法制备的精制木聚糖的酶转化,产物组分木二糖、木三糖占总转化产物90%以上;酶转化液中的低聚木糖,经活性炭脱色、732、717离子交换树脂脱盐,超滤和真空浓缩,制成低聚木糖糖浆,或真空干燥制成低聚木糖粉末,低聚木糖产品木二糖、木三糖含量占总糖组分90%以上。
文档编号C12N1/20GK1333371SQ00109788
公开日2002年1月30日 申请日期2000年7月7日 优先权日2000年7月7日
发明者陶文沂, 许正宏, 孙志浩, 敖宗华 申请人:无锡轻工大学