专利名称：无需克隆的线性表达载体构建方法
技术领域：
本发明涉及一种表达载体的构建方法，特别涉及一种无需克隆的线性表达载体的构建方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种无需克隆的线性表达载体的构建方法，以克服上述DNA拓扑异构酶I构建线性表达载体方法存在的不足。本方法利用(DNA+RNA)杂交体为引物，并采用一种只能以DNA为模板的DNA聚合酶扩增基因片段，然后将各片段连接，达到构建线性表达载体的目的。用此方法做成试剂盒，将大大方便使用者，为实现基因表达、蛋白功能等研究提供良好的技术平台。
本发明使用的Pfu DNA聚合酶和Vent exo-DNA聚合酶是一种只能以DNA为模板的DNA聚合酶，由于引物是(DNA+RNA)杂交体，因此经过扩增后的片段含有一小段单链RNA的粘端。在引物设计中，连接处的两个RNA片段互补配对，利用扩增后的RNA粘端就可以将片段连接起来。
在引物的合成中，包含引物的5’端磷酸化和5’端未磷酸化这两种情况。由于相邻片段之间的连接是通过一个片段的5’端磷酸基，和另一片段的3’端羟基形成磷酸二酯键实现连接的。当相邻片段的连接处含有5’端未磷酸化的引物时，扩增后该连接处因5’端缺乏磷酸基而不能实现连接，因此必须在扩增之后将相应的片段进行磷酸化反应，引入5’端的磷酸基，然后再连接片段，完成载体的构建。当然，如果相邻片段连接处引物的5’端都已磷酸化，则扩增后的磷酸化步骤是不需要的。
本发明的技术方案如下本发明提供一种线性表达载体的构建方法，其步骤包括1.设计引物1)相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对5’端经磷酸化的引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段RNA序列，引物1和引物2的RNA序列互补配对；2)启动子正向引物和终止子反向引物仪包括和扩增片段互补的DNA序列；2.分别以相应DNA片段为模板，用上述引物和只能以DNA为模板的DNA聚合酶进行PCR扩增，得到扩增产物；3.将扩增产物片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体。
本发明提供的构建线性表达载体的方法，步骤2所用的DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶或Vent exo-DNA聚合酶；步骤3连接反应所使用的连接酶为T4 DNA连接酶；步骤3之后，还包括将所得线性表达载体进行PCR扩增；步骤1的引物设计中RNA序列所含核糖核苷酸数为2-10个，优选3-6个核糖核苷酸组成的RNA序列。
若相邻片段的连接处含有5’端未磷酸化的引物，片段扩增后需要增加磷酸化步骤，则本发明构建线性表达载体的方法如下1.设计引物1)相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段RNA序列，引物1和引物2的RNA序列互补配对，并且这类引物中至少有一个引物的5’端未被磷酸化；2)启动子正向引物和终止子反向引物仅包括和扩增片段互补的DNA序列；2.分别以相应DNA片段为模板，用上述引物和只能以DNA为模板的DNA聚合酶进行PCR扩增，得到扩增产物；3.将扩增产物中含有引物设计1)中未磷酸化引物的DNA片段进行磷酸化反应，得到待连接片段；4.将各待连接片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体。
本发明提供的构建线性表达载体的方法，步骤2所用的DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶或Vent exo-DNA聚合酶；步骤4连接反应所使用的连接酶为T4 DNA连接酶；步骤4之后，还包括将所得线性表达载体进行PCR扩增；步骤1的引物设计中RNA序列所含核糖核苷酸数为2-10个，优选3-6个核糖核苷酸组成的RNA序列。
本发明提供的构建线性表达载体的方法具有以下特点适用范围广，无论目的基因含有何种DNA序列都可以应用，是构建线性表达载体的一种新方法。
在片段B和C的连接处设计一对5’端经磷酸化的引物1’和2’1’是目的基因片段GFP反向引物，2’是终止子BGHpA的正向引物。它们都包括一段DNA序列和一段RNA序列，其中DNA序列是和待扩增片段互补的，RNA序列在图中如方框所示，1’和2’的RNA序列互补配对。
设计启动子CMV的正向引物3和终止子的反向引物4。
本实施例中引物中的RNA序列包含6个核糖核苷酸，并且引物3、1、2、1’、2’和引物4的5’端都己磷酸化。引物序列如下表。
表1引物
其中大写字母表示的是含6个核糖核苷酸的RNA序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段按下列条件分别进行三个片段的PCR扩增质粒模板(22.5ng/μl) 1μl10X PCR缓冲液5μl10mM dNTP1μl正向引物(100ng/μl) 1μl反向引物(100ng/μl) 1μlPfu DNA聚合酶(3unit/μl) 1μl无RNA酶的水 40μl总体积 50μl其中PCR缓冲液100mM KCl，160mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，200mMTris-HCL，PH8.8，1％Trition X-100 and 1mg/ml BSA。
以上混合物以94℃初始变性5分钟，随后以94℃ 30秒，60℃30秒，72℃ 1分钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。得到启动子扩增产物A’、目的基因片段扩增产物B’和终止子扩增产物C’。
(3)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)A’500ng，B’578.75ng，C’275ng(即摩尔比1∶1∶1)，用DNA连接试剂盒(Takara)在室温下连接，先加入等体积溶液II混匀，再加入2倍体积的溶液I混匀5-10分钟(溶液I和溶液II为试剂盒中自带溶液)，即得到线性表达载体，可直接用于转染受体细胞。实施例2构建含CMV(巨细胞病毒)启动子片段A，GFP(绿色荧光蛋白)片段B，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)C的线性表达载体在该实施例中，引物中的RNA序列包含4个核糖核苷酸，引物1、2、1’、2’的5’端都己磷酸化，引物3和4的5’端均未磷酸化，并且线性表达载体经过第二次PCR扩增。其构建过程如图2所示(1)设计引物引物1、2，1’、2’，和3、4构建原理同实施例1。引物序列见下表。
表2引物
其中大写字母表示的是含4个核糖核苷酸的RNA序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段方法同实施例1
(3)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)A’100ng、B’115.5ng、C’39.11ng(即摩尔比1∶1∶1)混合，加入T4 DNA连接酶1μl(3unit/μl)，室温下反应30分钟，得到连接产物线性表达载体D’。
(4)以连接产物为模板PCR扩增连接产物 2μl10X PCR缓冲液 5μl25mM Mgcl23μl10mM dNTP 1μlCMV正向引物(100ng/μl)1μlBGHpA反向引物(100ng/μl) 1μlTaq酶(3unit/μl) 1μl无RNA酶的水 37μl总体积50μlPCR缓冲液500mM KCl.10mM Tris-HCl，(PH9.0)以上混合物以94℃初始变性5分钟，随后以94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，即得到扩增后的线性表达载体D。实施例3构建含EF-1α启动子片段A，GFP片段B，BGHpA片段(包含终止子)C的线性表达载体以质粒pEF/myc/nuc为模板扩增得到启动子EF-1α序列，以质粒pCMV/myc/cyto/GFP为模板，分别扩增得到GFP片段和BGHpA片段，在该实施例中，引物中的RNA序列包含6个核糖核苷酸，引物3、1、2、1’、2’和引物4的5’端都未磷酸化。PCR扩增后将三DNA片段磷酸化，再经过连接反应得到线性表达载体D’。其构建过程如图3所示
(1)设计引物引物1、2，1’、2’，和3、4构建原理同实施例1。并且引物5’端均未被磷酸化。引物序列见下表。
表3
其中大写字母表示的是含6个核糖核苷酸的RNA序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段按下列条件分别进行三个片段的PCR扩增质粒模板(22.5ng/μl) 1μl10X PCR缓冲液5μl10mM dNTP1μl正向引物(100ng/μl) 1μl反向引物(100ng/μl) 1μlVent exo-DNA聚合酶(2000unit/1ml) 1μl无RNA酶的水 40μl总体积 50μl其中PCR缓冲液100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，200mMTris-HCL，PH8.8，1％Trition X-100。
以上混合物以94℃初始变性5分钟，随后以94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。得到启动子扩增产物A’、目的基因片段扩增产物B’和终止子扩增产物C’。
(3)T4激酶分别将三个片段磷酸化磷酸化方案目的基因片段 2μgT4 DNA连接酶缓冲液 2μlT4多核苷酸激酶(10uint/μl) 1μl无RNA酶的水 20-X总体积 20μl37℃反应30分钟。
T4 DNA连接酶缓冲液500mM Tris-HCl 100mM MgCl2，100mM DTT，10mMATP，250ug/ml BSA。
X表示除了无菌水以外的其它溶液体积之和。
(4)连接反应得到(EF-1α+GFP+BGHpA)方法同实施例1。实施例4构建含EF-1α启动子片段A，GFP片段B，BGHpA片段(包含终止子)C的线性表达载体在该实施例中，引物中的RNA序列包含6个核糖核苷酸，引物1、2，1’、2’中含有5’未被磷酸化的引物，连接反应得到的线性表达载体经过第二次PCR扩增。其构建过程如图4所示(1)设计引物引物1、2，1’、2’，和3、4构建原理同实施例1。引物3、4和引物1的5’端未磷酸化；引物2、1’和引物2’的5’端已磷酸化。引物序列见下表。
表4
其中大写字母表示的是含6个核糖核苷酸的RNA序列。
(1)PCR扩增三个DNA片段方法同实施例3。
(3)T4激酶将启动子EF-1α片段磷酸化方法同实施例3。
(4)连接反应得到(EF-1α+GFP+BGHpA)(5)以连接产物为模板PCR扩增步骤(4)和(5)方法同实施例2。
用此方法构建线性表达载体，其适用范围广，不受目的DNA片段序列变化的影响。构建的线性表达载体可直接用于转化宿主细胞表达目的蛋白，可以为基因表达调节、抗体和疫苗的生产、蛋白功能研究等领域提供技术平台。
权利要求
1.一种线性表达载体的构建方法，其步骤包括1)设计引物a.相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对5’端经磷酸化的引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段RNA序列，引物1和引物2的RNA序列互补配对；b.启动子正向引物和终止子反向引物仅包括和扩增片段互补的DNA序列；2)分别以相应DNA片段为模板，用上述引物和只能以DNA为模板的DNA聚合酶进行PCR扩增，得到扩增产物；3)将扩增产物片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体。
2.按权利要求1所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤2)所用的DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶或Vent exo-DNA聚合酶。
3.按权利要求1所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤3)之后，还包括将所得线性表达载体进行PCR扩增。
4.按权利要求1所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤3)连接反应所使用的连接酶为T4 DNA连接酶。
5.按权利要求1所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤1)的引物设计中RNA序列所含核糖核苷酸数为2-10个。
6.按权利要求5所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，引物设计中采用3-6个核糖核苷酸组成的RNA序列。
7.一种线性表达载体的构建方法，其步骤包括1)设计引物a.相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段RNA序列，引物1和引物2的RNA序列互补配对，并且这类引物中至少有一个引物的5’端未被磷酸化；b.启动子正向引物和终止子反向引物仅包括和扩增片段互补的DNA序列；2)分别以相应DNA片段为模板，用上述引物和只能以DNA为模板的DNA聚合酶进行PCR扩增，得到扩增产物；3)将扩增产物中含有引物设计a)中未磷酸化引物的DNA片段进行磷酸化反应，得到待连接片段；4)将各待连接片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体。
8.按权利要求7所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤2)所用的DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶或Vent exo-DNA聚合酶。
9.按权利要求7所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤4)之后，还包括将所得线性表达载体进行PCR扩增。
10.按权利要求7所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤4)连接反应所使用的连接酶为T4 DNA连接酶。
11.按权利要求7所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤1)的引物设计中RNA序列所含核糖核苷酸数为2-10个。
12.按权利要求7所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，引物设计中采用3-6个核糖核苷酸组成的RNA序列。
全文摘要
本发明涉及一种线性表达载体的构建方法，具体地，本方法利用(DNA+RNA)杂交体为引物，用一种只能以DNA为模板的DNA聚合酶扩增基因片段，产生含RNA突出端的扩增产物，利用相邻RNA突出端的互补性将各片段连接，达到构建线性表达载体的目的。本发明操作简单，适用范围广，不受目的DNA片段序列变化的影响，构建的线性表达载体可直接用于转化宿主细胞表达目的蛋白，可以为基因表达、抗体和疫苗的生产、蛋白功能研究等领域提供技术平台。
文档编号C12Q1/68GK1414099SQ0211776
公开日2003年4月30日 申请日期2002年5月16日 优先权日2002年5月16日
发明者黄大卫, 辛文 申请人:中国科学院动物研究所