专利名称：中国对虾热休克蛋白70基因及其克隆方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体地说是一种中国对虾热休克蛋白基因70及其克隆方法。
背景技术：
热休克蛋白(HSP)是所有细胞能在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的一族蛋白，它们能使细胞对抗更为严重的应激损伤。其中HSP70是最为保守和重要的一个热休克蛋白家族。HSP70作为分子伴侣参与细胞新生蛋白的正确折叠、组装以及错误折叠蛋白的解折叠、变性蛋白的复性或清除。热休克蛋白在正常生理条件下也有一定水平的表达，在热休克、重金属离子、病毒或病菌感染等因素的刺激下表达上调，参与对机体细胞的保护，是一种非特异性细胞保护蛋白。人类及医学上的大量研究资料表明，HSP70还具有抗氧化作用、协同免疫作用、抗细胞凋亡作用。HSP70广泛的生理和病理作用已成为当今生命科学研究的热点，其潜在的应用前景也日益受到重视。(1)细胞在正常致死温度下存活的能力与热休克蛋白的积累有关，而且已经证实Hsp70s的过量表达可提高紫外线照射后细胞的存活率。大量的体外模型系统正在研究将Hsps用于移植过程中器官的保护以及保护组织免受缺血和神经伤害(文献Nadler S.G.，TepperM.A，Schater B.，et al.，Science，1994；258484-486)。(2)由于HSP具有分子伴侣活性，因而其在蛋白质工程方面的作用早已引起人们的重视。Ryan等发现在热休克条件下进行先期诱导培养，对于在E.coli中人的重组蛋白的表达和其转译后修饰有非常重要的作用。翻译后修饰的程度与特定的热休克蛋白的浓度有关，而且实验发现不仅重组蛋白的表达加强，这些蛋白的同质性也有提高，从而有利于后处理过程的进行。(3)热休克蛋白可能代表了一类新的免疫抑制剂结合蛋白15-DSG结合蛋白。15-DSG可与Hsp70s、Hsp90s发生特异性结合，而且DSG与它的结构类似物的免疫抑制剂活性和它们与热休克蛋白的亲和力有关，不同的热休克蛋白可与不同的免疫抑制剂发生结合，因此，热休克蛋白可能为新的免疫抑制药物提供了靶子。(4)热休克蛋白参与了多种生物和免疫应答过程，而且在许多疾病治疗方面有很大的潜力。用一些化学物质或一些其他的方法来诱导产生热休克蛋白，会使生物体对一些破坏性的刺激产生一定的抗性。
热休克反应和热休克蛋白在许多生物中都已被发现，它是生物抵抗不良环境的一种防御机制。如果能用基因工程方法增强HSP基因的表达，使动物、植物能忍受冷热及其他不利环境的影响，这无疑会带来巨大的经济价值。目前动植物的减产往往由于恶劣的环境造成，如能使动植物可以经受相当大的环境考验，就有希望获得高产。随着人们生活水平的提高，对海产品的需求愈来愈大。中国对虾是我国重要的海产养殖品种。但90年代以来，对虾病特别是白斑综合征病毒(WSSV)病大规模暴发，使海产养殖业遭受严重损失。国内许多学者在对虾病防治方面作了大量的工作，并且取得了很多进展。但到目前为止，对虾病毒病仍是困扰对虾养殖业的一个难题。研究表明WSSV的爆发流行与气候(台风、暴雨、寒潮)和水体理化因子(水温、盐度、PH值、无机盐)的变化有关。WSSV在对虾体内潜伏感染，受水体理化因子的影响下，对虾体内WSSV数量升高，当达到一定数量时，即转为急性感染期，导致WSSV的爆发流行。在这种情况下虾的产量远远不能满足人们对海产品的大量需求。所以，如何预防对虾病的大规模暴发及提高对虾抗病力已成为科技工作者的研究热点。而对虾热休克蛋白基因的成功克隆和测序，将为从根本上解决该难题提供新的方法和途径。
发明内容
本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因克隆技术、DNA测序技术对中国对虾HSP70基因进行了研究，目的是提供一种中国对虾热休克蛋白70基因的核苷酸序列和氨基酸序列及该基因的克隆方法，并使对虾病防治及提高对虾抗病力成为可能。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下中国对虾热休克蛋白70基因具有序列表中SEQ ID NO 1碱基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其克隆方法(1)从中国对虾的肝脏、眼柄、肌肉、血液、鳃、胃或肠中提取总RNA；
(2)然后进行cDNA第一链合成，其中反转录酶引物采用5′＞GGCCACGCGTCGACTAGTACT(16)(A/C/G)(A/G/T/C)＜3′；(3)利用一对引物进行RT-PCR反应，克隆得到对虾热休克蛋白70基因；其中所述引物为正向引物P15′＞GAG AGA AGA GCA GAC GTGTTA CA＜3′；反向引物P45′＞TGA TCT ACG ATG GGT CGA TIT G＜3′；另外，所述引物还可以为序列表中SEQ ID NO.1碱基序列片段。
本发明具有如下优点1.采用本发明能够利用引物P1、P4从中国对虾中克隆到1种热休克蛋白70基因(称为中国对虾HSP70基因)，采用本发明对虾热休克蛋白基因的成功克隆和测序，首次搞清了它的全部编码序列和部分非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因(所以可以不再用p1、p4)，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。
2.采用本发明使通过生物工程手段提高对虾对不同环境的适应能力，消除或减缓有害环境因素对对虾机体的不利影响，阻止由某些病原微生物或不良环境引起的对虾烈性疾病的大规模爆发成为可能，提高中国对虾抗病力及抗逆境能力，从而大大促进对虾养殖业的发展。
图1为本发明一个实施例的PCR反应程序中反应产物在琼脂糖凝胶电泳检测图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例详述本发明。
实施例1一种克隆的中国对虾热休克蛋白(HSP)70基因，具有SEQ ID NO 1所示的序列同系基因一(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度2090碱基对
*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)(2)SEQ ID NO.2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度652氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽实施例2 中国对虾HSP70基因的克隆方法本发明从中国对虾中克隆上述HSP70基因的方法包括(1)从中国对虾的肝脏组织中提取总RNA；(2)然后进行cDNA第一链合成；(3)利用一对引物进行PCR，得到对虾HSP70基因。
其中所述正向引物P15′＞GAG AGA AGA GCA GAC GTG TTA CA＜3′；反向引物P45′＞TGA TCT ACG ATG GGT CGA TIT G＜3′为了获得高质量的RNA，本发明采用以下RNA提取程序，具体操作条件如下1.总RNA提取1)制备提取液RNA提取液成分含4M异硫氰酸胍，0.5％十二烷基肌氨酸钠，26mM柠檬酸钠(PH4.0)，0.1M β-巯基乙醇；具体制备方法称取94.6克异硫氰酸胍，溶解于103ml DEPC处理过的无RNA酶超纯水中，再分别加入0.78M的柠檬酸钠6.6ml，10％的十二烷基肌氨酸钠9.9ml，使用前加入1.44ml的14.4M β-巯基乙醇储存液，提取液可在常温下闭光保存数月(本实施例为5个月)；2)从中国对虾分离肝脏组织约2克，置于含20ml提取液的50ml离心管，8000转/分钟匀浆10～30秒，置于冰上5分钟，加入2M醋酸钠(PH4.0)2ml，混匀，加17ml水饱和酚，6ml氯仿，剧烈振荡10秒，置冰上15分钟，在4℃以12000g离心15分钟，抽提蛋白质；3)将水相转入另一个新50ml离心管，加入20ml异丙醇置于-20℃沉淀30分钟；在4℃以12000g离心10分钟，得沉淀RNA；4)RNA再纯化及成品的获得用600μl步骤1)所述提取液溶解沉淀，加入600μl异丙醇和180μl醋酸钠(2M，pH4.0)，混匀，转入一1.5ml离心管置于-20℃30分钟；12000g离心20分钟；用75％乙醇淋洗RNA沉淀然后离心5分钟；晾干RNA沉淀；用50μl无RNA酶的水溶解沉淀。
2.cDNA第一链合成操作按Gibco公司的SuperscriptTMII反转录酶使用说明进行，反转录酶引物为5′＞GGCCACGCGTCGACTAGTACT(16)(A/C/G)(A/G/T/C)＜3′；具体如下1微升约1.5微克总RNA，加1微升(10皮摩尔/微升)引物5′＞GGCCACGCGTCGACTAGTACT(16)(A/C/G)(A/G/T/C)＜3′，11.75微升无RNA酶水，混匀，70℃温育6分钟，立即置冰上，依次加入5倍反转录酶缓冲液5微升，2.5微升(0.1摩尔/升)二硫苏糖醇(DTT)，1.25微升(每样10毫摩尔/升)脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，1微升(40单位/微升)RNA酶抑制剂，1.5微升(200单位/微升)SuperscriptTMII反转录酶，42℃反应120分钟。70℃10分钟终止反应。
3.PCR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件本发明根据所测中国对虾EST中与HSP70有关的序列设计一对引物正向引物P15′＞GAG AGA AGA GCA GAC GTG TTA CA＜3′反向引物P45′＞TGA TCT ACG ATG GGT CGA TIT G＜3′首先将下列试剂混在一起10×ExTaq Buffer(Mg2+Plus)5μl(Taq DNA聚合酶缓冲液购于保生物工程(大连)有限公司)模板cDNA 1μl引物P1(10pmol/μl)1μl引物P4(10pmol/μl)1μl脱氧核苷酸混合物(10mM)4μlTaKaRa Ex Taq DNA聚合酶 0.25μl(5U/μl)；购于保生物工程(大连)有限公司；
灭菌水 37.75μl总体积 50μlPCR反应程序为94℃预变性2min，然后进入下列循环94℃30s，68.1℃60s，72℃90s，35个循环，最后72℃延伸10min。取反应产物5μl在1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。(见图1)4.反应产物纯化利用德国卡珍(QIAGEN)公司产品(QIAquick GelExtraction Kit)，操作步骤按产品说明书进行。
5.HSP70基因克隆取纯化产物3微升，连接于50ng pUCm-T载体(上海生工产品，操作步骤详见说明书)。将全部连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升氨苄青霉素)过夜培养。
6.质粒纯化收取过夜培养菌液1-2毫升，离心(10000转，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNAPurification System，美国普洛麦格Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
7.序列测定与同源检索采用ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer进行测序，反应试剂为PERKIN ELMER公司的ABI PRISMRBigDyeTMTerminator Cycle测序试剂盒。
8.HSP70基因的确定序列测定后，通过网上相似性和同源性检索，与人HSP70-8、牛HSC70和虹鳟HSP70(都属于HSP70家族成员基因)的氨基酸相似性分别为87.2％、87.2％、88.6％，提示该基因属于HSP70基因，并且在不同物种间表现出较高的保守性，是一种非特异性保护蛋白，它与生物环境适应性及免疫有关。从该基因入手有可能找到对虾病毒病防治或提高对虾抗病力的新方法，有很大的开发应用前景。
另外，本实施例在步骤(3)中所述引物还可以采用序列表中SEQ IDNO.1碱基序列片段。
实施例3与实施例2不同之处在于从中国对虾的眼柄组织中提取总RNA。
实施例4
与实施例2不同之处在于从中国对虾的肌肉组织中提取总RNA。
实施例5与实施例2不同之处在于从中国对虾的血液组织中提取总RNA。亦可从中国对虾的鳃、胃或肠组织中提取总RNA。
权利要求
1.一种中国对虾热休克蛋白70基因，其特征在于具有序列表中SEQID NO 1碱基序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.一种按照权利要求1所述中国对虾热休克蛋白70基因的克隆方法，其特征在于包括(1)从中国对虾的肝脏、眼柄、肌肉、血液、鳃、胃或肠组织中提取总RNA；(2)然后进行cDNA第一链合成，其中反转录酶引物采用5′＞GGCCACGCGTCGACTAGTACT(16)(A/C/G)(A/G/T/C)＜3′；(3)利用一对引物进行RT-PCR反应，克隆得到对虾热休克蛋白70基因；其中所述引物为正向引物P15′＞GAG AGA AGA GCA GAC GTG TTA CA＜3′；反向引物P45′＞TGA TCT ACG ATG GGT CGA TTT G＜3′。
3.按照权利要求2所述中国对虾热休克蛋白70基因的克隆方法，其特征在于步骤(3)中所述引物还可以为序列表中SEQ ID NO.1碱基序列片段。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术领域，具体地说是一种中国对虾热休克蛋白基因70及其克隆方法。它具有序列表中SEQ ID NO 1碱基序列及SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列；包括1)从中国对虾的组织中提取总RNA；2)进行cDNA第一链合成；3)利用一对引物进行RT－PCR反应，克隆得到对虾热休克蛋白70基因；其中所述引物为正向引物P15′＞GAG AGA AGA GCA GAC GTG TTA CA＜3′；反向引物P45′＞TGA TCT ACG ATG GGT CGA TTT G＜3′。本发明首次从中国对虾中克隆到了1种热休克蛋白70基因，搞清了它的全部编码序列和部分非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，使通过生物工程手段阻止由某些病原微生物或不良环境引起的对虾烈性疾病的大规模爆发成为可能。
文档编号C12P19/34GK1534097SQ0311134
公开日2004年10月6日 申请日期2003年4月2日 优先权日2003年4月2日
发明者相建海, 焦传珍, 王在照, 李富花 申请人:中国科学院海洋研究所