专利名称：一种高效快速的真核蛋白表达和生产系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效快速的真核蛋白表达和生产系统。具体地说是一种以特定长度的山羊β-酪蛋白基因的调控区作为真核目的基因的主要调控元件，直接指导目的基因在处于稳定泌乳期中的乳腺中高水平快速表达和生产的系统。该系统包括山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA和处于稳定泌乳期的山羊乳腺两部分。其中在山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA质粒DNA上，于山羊β-酪蛋白基因的调控区下游依次克隆有接头(linker)、牛生长激素poly(A)信号序列、pUC18 DNA序列；上游含有鼠免疫球蛋白(Ig)MAR序列。目的基因在克隆入表达载体pMRPA后，以生理盐水溶液形式并以直接注入的方式导入山羊乳腺，目的基因即可在山羊奶中获得高效快速表达。
背景技术：
目前用于目的基因表达的真核载体系统主要是以巨细胞病毒立即早期启动子或SV40病毒早、晚期启动子序列等为调控元件，这些启动子序列无明显的组织和细胞特异性，适用于在多种细胞内表达，但这些表达载体需要通过磷酸钙或脂质体等转染剂在严格无菌的条件下转化细胞，表达水平也很低。因此，要获得较高产量的基因表达产物，需较长的时间对细胞进行克隆、筛选和加压方能实现。这些以病毒启动子等为调控元件的普通表达载体，也可在转化的组织中表达，组织转染通常采用基因枪、DNA-脂质体包裹注射以及病毒载体转染等技术，这些技术复杂且费用较高，而且无论表达水平还是组织表达的特异性均不能满足回收和鉴定的要求。在转基因动物研究领域中，以乳腺组织特异性表达载体构建动物乳腺生物反应器，使目的蛋白表达到奶中，表达水平虽然较高，但其构建过程复杂，获得可高效表达目的蛋白的转基因个体需要很长的周期，而且由于载体在基因组中的整合位点不同，表达水平和效果在不同个体之间也不尽相同。乳腺是天然高效的蛋白合成组织，乳蛋白合成在泌乳期极为旺盛，总蛋白含量虽然在不同动物间有所差异，但在奶牛和奶山羊乳汁中蛋白含量可达3.1％～4.0％。因此利用泌乳期乳腺组织表达外源性目的蛋白比普通的培养细胞和组织具有明显的优势。但采用普通病毒启动子等为主要调控元件的表达载体在乳腺组织中表达时，由于载体不具有组织特异性调控元件，也不能使目的基因得到高水平表达。乳蛋白中的主要成份包括乳清蛋白和乳酪蛋白。山羊乳汁中酪蛋白含量约占乳汁总重的2.6％，是比较高的蛋白成份之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效快速的真核蛋白表达和生产系统。乳腺在泌乳期具有极其旺盛的代谢功能，可以不需任何特殊的转染剂或理化学方法，就可将注入其中的目的基因摄入腺泡细胞，并使其得到表达；而且表达是在质粒DNA被摄入细胞后即开始了，时间可持续一周以上。通过该系统，目的基因可以在山羊乳腺组织特异性表达载体指导下，快速高效地表达其产物到山羊奶中，因此不仅可用于目的基因的表达鉴定，而且可用于目的蛋白的快速生产。
本发明所建立的快速高效蛋白表达和生产系统的独特之处在于第一，所构建的乳腺组织特异性表达载体pMRPA采用山羊β-酪蛋白基因中调节表达的特定长度的调控元件，碱基序列位置为-1051～+81，该元件保证了目的基因只在山羊乳腺组织中表达，并保证了在稳定泌乳期高水平表达；第二，在表达调控区下游插入了含有多个单一克隆位点的接头，其序列为5′-CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC-3′，其中包含有Apa I，Not I，Mlu I，Sal I，EcoR V，Cla I，Bam HI，Bst BI。限制性内切酶识别序列，可适用于多种目的基因的插入；第三，目的基因表达的直接靶组织是处于稳定泌乳期即产羔10-20天后的山羊乳腺。第四，目的基因的乳腺组织特异性表达载体仅以生理盐水溶液的形式、并且仅以直接注射的方式导入乳腺组织，目的蛋白即可获得表达。载体中乳腺组织特异性调控序列是保证目的基因在乳腺中直接、高效、快速表达的主要调控元件。除了它和接头以外，其它的序列包括为了有效实现目的基因表达的必要元件和实现载体所载目的基因在大肠杆菌中扩增所必需的克隆质粒，不是本发明特有的序列。
一、山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA(见图1)图1是本发明中山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA的结构。其基础框架为含氨苄青霉素的pUC18。MAR为小鼠免疫球蛋白基质结合区序列，β-casein promoter为含山羊β-酪蛋白启动子的乳腺组织特异性调控序列，MCS为多克隆位点，bGH poly A为牛生长激素poly A信号序列。
二、载体的制备1、各部分来源a.山羊β-酪蛋白调控序列(1132bp)在-1051～+81序列两端合成一对引物，通过聚合酶链式反应(PCR)自莎能奶山羊基因组中扩增出1132bp核酸片段，克隆于pGEM-T载体上。
b.多克隆位点(接头)人工合成两条互补但两端突出的寡核苷酸5′-CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC-3′，5′-TTCGAAGGATCCATCGATGATATCGTCGACACGCGTGCGGCCGCGGGCC-3′其中含有Apa I，Not I，Mlu I，Sal I，Eco RV，Cla I，Bam HI，Bst BI位点。
c.小鼠免疫球蛋白基质结合区(MAR)序列、牛生长激素poly A信号序列(bGH poly A)以及pUC18骨架序列均来源于本实验室保存的商品质粒中。
2、pMRPA的构建过程1)根据山羊β-酪蛋白基因上游调控序列及cDNA非翻译区序列设计并合成2条引物Primer15′TCAGACTCTATTGTAGTACT3′Primer25′CTCAGATATAATTTCAGTGTATCTG3′。
2)Primer1和Primer2各100pmoles，2.5mM 4种dNTPs 2μl，Taqplus DNA聚合酶1U，10×PCR缓冲液4μl，25mM MgCl24μl，加双蒸水至40μl。95℃预变性3min；再进入95℃ 30s，52℃ 1min，72℃1min，25 cycles PCR循环。琼脂糖凝胶电泳，回收1.132kb的核酸片段。
3)取1.132kb片段50ng，pGEM-T载体25ng，Ligation bufier 15μl，Ligase 1U，混匀后16℃过夜。取5μl转化JM109。对重组子鉴定得到质粒pT-gP。
4)对pT-gP进行测序，结果为-1051gtctgg ctcagactct attgtagtacttagggtaag accctcctcc tgtatgggct ttcattttct ttcttgcttc cctcatttgc ccttccatgaatactagctg ataaacattg actataaaag atatgaggcc aaacttgagc tgtcccattt taataaatctgtataaataa tatttgttct acaaaagtat tatctaaata aatgttactt tctgtcttaa aatccctcaacaaatcccca ctatctagag aataagattg acattccctg gaatcacagc atgctttgtctgccattatc tgaccccttt ctctttctct cttctcacct ccatctactc ctttttcctt gcaattcatgacccagattc actgtttgat ttggcttgca tgtgtgtgtg ctgagttgcg tctgactgtt atcaaccccatgaatgatag tccaccaggc tctactgtcc atgaaatttt ccagtcaaga atactggagtggattgcatt tcctactcca tttgattaat ttagtgactt ttaaatttct ttttccatat tcgggagcctattcttcctt tttagtctat actctcttca ctcttcaggt ctaaggtatc atcgtgtgct tgttagcttgttactttctc cattatagct taagcactaa caactgttca ggttggcatg aaattgtgtt ctttgtgtggcctgtatatt tctgttgtgt attagaattt accccaagat ctcaaagacc cactgaatac taaagagacctcattgtggt tacaataatt tggggactgg gccaaaactt ccgtgcatcc cagccaagatctgtagctac tggacaattt catttccttt atcagattgt gagttattcc tgttgaaatg ctccccagaatttctgggga cagaaaaata ggaagaattc atttcctaat catgcagatt tctaggaattcaaatccact attggtttta tttcaaacca atgccattaa ctaaatcaga tcattatccattcagcttct ccttcacttc ttctcctcta
ctttggaaaa aaggtaagaa tctcagatat aatttcagtg tatctg(+81)其中 为CAT框， 为TATA框，下划横线部位为转录起始点。
5)取pcDNA3 1μg，NEB Buffer-4 10μl，加入Mlu I 20U，SmaI 10U，双蒸水至100μl，37℃ 1.5h。琼脂糖凝胶电泳回收1.931kb含牛生长激素poly(A)信号序列(bGHPA)的小片段。与经Sma I酶切、脱磷的质粒pMAR连接，转化JM109，筛选鉴定，获得重组质粒pMRA；6)取pT-gP 1μg，NEB Buffer-4 10μl，加入Mlu I 20U和Apa I10U，双蒸水至100μl，37℃ 1.5h。琼脂糖凝胶电泳回收1.144kb山羊β-酪蛋白启动子，与经同样酶切、回收的pMRA大片段连接，转化宿主菌JM109，筛选获得重组质粒pMRPA2。
7)取pMRPA2 50ng，NEB Buffer-3 10μl，加入Mlu I 10U和NotI 10U，双蒸水至100μl，37℃ 1.5h，琼脂糖凝胶电泳回收大片段。取回收大片段30ng，加2.5μM dNTPs 1μl，Klenow 5U，37℃ 20min，70℃ 15min，取1/3体积，加ligase 1U，2μl连接物转化宿主菌JM109，筛选获得重组质粒pMRPA1。
8)将合成的5′带磷的多克隆位点接头5′-CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC-3′和5′-TTCGAAGGATCCATCGATGATATCGTCGACACGCGTGCGGCCGCGGGCC-3′各100pmol于95℃ 3min，室温退火15min。取pMRPA1 1μg，加Apa I 10U，NEB buffer 5μl，双蒸水至50μl，消化后回收线性化DNA。取经退火的接头100pmol，线性化DNA 50ng，ligase 1U，Ligation buffer 1μl，加双蒸水至10μl，16℃连接过夜。转化宿主菌JM109，小提质粒经鉴定、筛选，得到载体pMRPA(如图2)。
3、山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA的酶切图谱，如图34、pMRAR各部分的功能图1描述了山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA的总体结构，图2说明了各功能元件的来源和组装各元件的方法，图3显示了pMRPA的酶切图谱，通过所列举的限制性内切酶组合可将各元件切出或切断，其酶切位点的位置及排列顺序为本载体所特有。
本发明采用了山羊β-酪蛋白基因转录起始点上游-1051～-1、β-酪蛋白mRNA 5′非翻译区+1～+48(第一个外显子)以及第一个内含子部分序列+49～+81的区域。该区域首先保证了调控区主要调控元件(如TATA、CAAT盒等)的完整性，同时，由于含有β-酪蛋白mRNA5′非翻译区+1～+48(第一个外显子)以及第一个内含子的部分序列+49～+81，有利于其在泌乳期保持较高的起始转录水平。本发明中用于将目的基因克隆到载体上的接头为ApaI-NotI-MluI-SalI-EcoRI-ClaI-BamHI-BstBI，其位置是紧接在山羊β-酪蛋白基因第一个内含子部分序列之后，在载体中的功能在于它适于多种外源性目的基因的插入。牛生长激素polyA信号序列是真核生物mRNA加尾信号中效率较高的一种，在真核表达载体中应用较为普遍，其功能是保证mRNA加工后有效翻译。本发明中的小鼠免疫球蛋白基质结合区(MAR)序列位于山羊β-酪蛋白启动子上游，其功能在于它可促进下游双链DNA的解链，从而有利于目的基因转录。pUC18部分骨架序列含有氨苄抗性(Amp+)、质粒复制起始点(ori)等序列，分别用于转化子的抗性选择和启动质粒DNA在大肠杆菌中的复制。
三、pMRPA载体中目的基因的表达pMRPA载体中的接头含有ApaI-NotI-MluI-SalI-EcoRI-ClaI-BamHI-BstBI多克隆位点，在该处可任意插入目的基因。
目的基因(如组织型纤溶酶原激活剂(tPA)突变体cDNA和蚓激酶(LK)cDNA)在通过多克隆位点克隆到表达载体中后，通过质粒大规模制备方法，分别提纯表达载体，溶于生理盐水中，定量稀释至100～800μg/ml，取0.5～1ml缓慢注入单侧或双侧处于稳定泌乳期的山羊乳腺组织内(避免注入血管中)。2小时后至10天采集乳汁，即可用于目的基因产物的含量或活性测定。
本发明的积极效果在于1、目的基因克隆进表达载体后，不需任何转染剂，仅以生理盐水溶液形式，并且仅以组织直接注射的方式导入乳腺组织，目的基因即可获得表达，是一种更方便的表达系统；2、表达系统具有产物表达水平高、持续时间较长等优点；3、本发明可用于①通过表达未知蛋白，可对未知蛋白进行初步纯化并进行活性鉴定；②通过羊奶快速生产具有重要生物功能的药物蛋白。
图1为本发明得到的山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA；图2为表达载体pMRPA的构建过程图3为表达载体pMRPA的酶切图谱图4、图5为本发明得到的表达载体pMRPA-tPA；pMRPA-LK；图6为本发明mFAPA检测tPA突变体(B1-3，C1-3)和蚓激酶(B4-6，C4-6)在山羊乳腺中表达的部分结果
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明作进一步描述实验例11、取质粒pMD-tPAm 1μg，在100μl总反应体积中分别加有10×NEB buffer-2 10μl，Hind III 10U，Kpn I 10U，37℃酶切1小时后，酚/氯仿抽提两次，加NaCl溶液至终浓度25mM，2.5倍体积无水乙醇，混匀，13000rpm 6min，沉淀溶于43μl水中，加5μl 10×Klenowbuffer，1U(1μl)Klenow，室温5min，补加1μl 2.5mM dNTPs，37℃20min，琼脂糖凝胶电泳，采用玻璃奶回收试剂盒回收2.1kb片段，酚/氯仿抽提两次，加NaCl溶液至终浓度25mM，2.5倍体积无水乙醇，混匀，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中。取100ng用于连接。
2、取pMRPA 1μg，在100μl总反应体积中分别含有10×NEBBuffer-3 10μl，100μg/ml BSA 1μl，EcoR V 10U，酶切后，酚/氯仿抽提两次，加NaCl溶液至终浓度25mM，2.5倍体积无水乙醇，混匀，13000rpm 6min，沉淀溶于44μl水中，加牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)Buffer 5μl，CIAP 1U，37℃ 15min，酚/氯仿抽提两次，加NaCl溶液至终浓度25mM，2.5倍体积无水乙醇，混匀，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中。取50ng于管中，加100ng步骤1中tPA cDNA片段，10×ligation buffer 1μl，ligase 1U，加水至10μl，21℃连接过夜。
3、取连接产物5μl，加入到100μl DH5α感受态细菌中，冰浴30min，42℃水浴90sec，冰浴3min，37℃ 50min，涂布到含氨苄琼脂板上，37℃培养过夜。
4、通过快速裂解液鉴定转化子，挑取分子量约为7.9kb的重组子，小量培养，小提质粒，经Not I酶切鉴定，得到正向连接的载体pMRPA-tPA(如图4)。
5、将pMRPA-tPA重组子划线培养，挑单个菌落于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，次日按1∶100比例接种到1000-5000ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养至24小时。冰浴后离心沉淀细菌，以1体积含20μg/ml RNAse的50mMTris.Cl(pH7.5)悬浮，2体积0.2N NaOH/1％SDS裂解，1.5体积3MNaAc(pH4.8)中和，离心弃沉淀，上清通过Qiagen DNA提取层吸柱，经洗涤和洗脱后稀释到生理盐水中，使其终浓度达到100～800μg/ml，获得注射用pMRPA-tPA溶液。
6、取0.5～1ml上述质粒DNA溶液于注射器中。对稳定泌乳期的山羊乳腺用碘酊和70％酒精消毒后，注射pMRPA-Tpa DNA溶液。可单侧注射，也可双侧同时注射；可单点注射，也可多点注射。避免注射到血管中。
7、2小时后(至10天)即可开始采集乳汁用于目的产物检测。
8、tPA突变体检测采用改良的纤维蛋白溶圈法(mFAPA)。
9、以PBS缓冲液配制1％的琼脂糖，溶化后待其温度降至55～60℃时，取8ml置玻璃容器内，加入10g/L纤维蛋白原1ml，1U/ml的凝血酶1ml，摇匀后倒入水平放置的5cm×10cm酶联板盖内，凝固后打孔(直径2～4mm)待用。
10、滴入20μl乳样，放入湿盒内37℃感作8小时以上；11、测定溶圈直径(如图6B1-3，C1-3)。根据标准品曲线计算乳汁样品中tPA突变体(表1)的含量。
表1注射800μg DNA时tPA突变体在山羊乳腺组织中表达结果(mg/L)注射材料PMRPA-tPAPMRPA 生理盐水羊编号1 2 3 4 5 6 112第一天14.9 52.4 22.9 35.5 23.7 46.3 0.0 0.0 0.0第九天4.015.0 7.5 8.3 7.4 4.7 0.0 0.0 0.0实验例21、取含蚓激酶(LK)cDNA片段的质粒pT-LK 1μg置Eppendorf管中，加入10×NEB Buffer-4 10μl，100μg/ml BSA 1μl，Apa I 10U，37℃酶切1小时后，琼脂糖凝胶电泳，采用玻璃奶回收试剂盒回收0.9kb片段，酚/氯仿抽提两次，加NaCl溶液至终浓度25mM，2.5倍体积无水乙醇，混匀，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中，取30ng用于连接。
2、取pMRPA 1μg，在100μl总反应体积中分别加有10×NEBBuffer-4 10μl，100μg/ml BSA 1μl，Apa I 10U，酶切后，酚/氯仿抽提两次，加NaCl溶液至终浓度25mM，2.5倍体积无水乙醇，混匀，13000rpm 6min，沉淀溶于44μl水中，加牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)Buffer 5μl，CIAP 1U，37℃ 15min，酚/氯仿抽提两次，加NaCl溶液至终浓度25mM，2.5倍体积无水乙醇，混匀，13000rpm 6min，沉淀溶于10μl水中。取50ng于管中，加100ng步骤1中LK cDNA片段，10×ligation buffer 1μl，ligase 1U，加水至10μl，21℃连接过夜。
3、取连接产物5μl，加入到100μl DH5α感受态细菌中，冰浴30min，42℃水浴90sec，冰浴3min，37℃ 50min，涂布到含氨苄琼脂板上，37℃培养过夜。
4、通过快速裂解液鉴定转化子，挑取分子量约为7.1kb的重组子，小量培养，小提质粒，经序列测定，得到正向连接的载体pMRPA-LK(如图5)。
5、将pMRPA-LK重组子划线培养，挑单个菌落于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，次日按1∶100比例接种到1000-5000ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养至24小时。冰浴后离心沉淀细菌，以1体积含20μg/ml RNAse的50mM Tris.Cl(pH7.5)悬浮，2体积0.2N NaOH/1％SDS裂解，1.5体积3M NaAc(pH4.8)中和，离心弃沉淀，上清通过Qiagen DNA提取层吸柱，经洗涤和洗脱后稀释到生理盐水中，使其终浓度达到100～800μg/ml，获得注射用pMRPA-LK溶液。
6、取0.5～1ml上述质粒DNA溶液于注射器中。对稳定泌乳期的山羊乳腺用碘酊和70％酒精消毒后，注射pMRPA-LK DNA溶液。可单侧注射，也可双侧同时注射；可单点注射，也可多点注射。避免注射到血管中。
7、2小时后(至10天)即可开始采集乳汁用于目的产物检测。
8、LK检测采用改良的纤维蛋白溶圈法(mFAPA)。
9、以PBS缓冲液配制1％的琼脂糖，溶化后待其温度降至55～60℃时，取8ml置玻璃容器内，加入10g/L纤维蛋白原1ml，1U/ml的凝血酶1ml，摇匀后倒入水平放置的酶联板盖内，凝固后打孔(直径2～4mm)待用。
10、滴入20μl乳样，放入湿盒内37℃感作8小时以上；11、测定溶圈直径(如图6B4-6，C4-6)。根据标准品曲线计算乳汁样品中LK(表2)的含量。
表2注射800μg DNA时LK在山羊乳腺组织中表达结果(mg/L)注射材料 PMRPA-LK PMRPA 生理盐水羊编号1 2 3 4 5 6 1 1 2第一天32.1 25.8 23.5 51.2 52.0 33.3 0.0 0.0 0.0第九天6.111.2 6.33.36.85.80.0 0.0 0.0
权利要求
1.一种高效快速的真核蛋白表达和生产系统，其特征在于由山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA和处于稳定泌乳期的山羊乳腺两部分组成；其中山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA，包含指导目的基因在奶中高效表达的具有特殊长度的山羊乳腺组织特异性表达调控序列、便于目的基因克隆于其中的人工合成的DNA接头(多克隆位点)片段、有利于目的基因mRNA转录后加工的牛生长激素poly(A)信号序列、促进目的基因独立表达的鼠免疫球蛋白(Ig)基质结合区(MAR)序列，以及供载体和目的基因在大肠杆菌中复制的部分pUC18 DNA序列。
2.根据权利要求1所述的山羊乳腺组织特异性表达载体pMRPA，其特征在于所述具有特殊长度的山羊乳腺组织特异性表达调控序列，指的是包含山羊β-酪蛋白基因上游5’端启动子调控区-1051～-1、β-酪蛋白mRNA 5′非翻译区+1～+48以及第一个内含子部分序列+49～+81的区域。其序列为gtctggctcagactct attgtagtac ttagggtaag accctcctcc tgtatgggct ttcattttct ttcttgcttccctcatttgc ccttccatga atactagctg ataaacattg actataaaag atatgaggccaaacttgagc tgtcccattt taataaatct gtataaataa tatttgttct acaaaagtat tatctaaataaatgttactt tctgtcttaa aatccctcaa caaatcccca ctatctagag aataagattg acattccctggaatcacagc atgctttgtc tgccattatc tgaccccttt ctctttctct cttctcacct ccatctactcctttttcctt gcaattcatg acccagattc actgtttgat ttggcttgca tgtgtgtgtg ctgagttgcgtctgactgtt atcaacccca tgaatgatag tccaccaggc tctactgtcc atgaaattttccagtcaaga atactggagt ggattgcatt tcctactcca tttgattaat ttagtgactt ttaaatttctttttccatat tcgggagcct attcttcctt tttagtctat actctcttca ctcttcaggt ctaaggtatcatcgtgtgct tgttagcttg ttactttctc cattatagct taagcactaa caactgttca ggttggcatgaaattgtgtt ctttgtgtgg cctgtatatt tctgttgtgt attagaattt accccaagat ctcaaagacccactgaatac taaagagacc tcattgtggt tacaataatt tggggactgg gccaaaacttccgtgcatcc cagccaagat ctgtagctac tggacaattt catttccttt atcagattgt gagttattcctgttgaaatg ctccccagaa tttctgggga cagaaaaata ggaagaattc atttcctaatcatgcagatt tctaggaatt caaatccact attggtttta tttcaaacca caaaattagc atgccattaaatactatata taaacagcca ctaaatcaga tcattatcca ttcagcttct ccttcacttcttctcctcta ctttggaaaa aaggtaagaa tctcagatat aatttcagtg tatctg
3.根据权利要求1所述高效快速的真核蛋白表达和生产系统，其特征在于所述的DNA接头片段位于乳腺组织特异性表达调控序列下游，其碱基序列为5′CGCGGCCGCCACGCGTGTCGACGATATCATCGATGATCCTTCGAAGGCC3′
4.根据权利要求1所述高效快速的真核蛋白表达和生产系统，其特征在于将所述的目的基因克隆入表达载体pMRPA后，目的基因表达载体以生理盐水溶液直接注射到山羊乳腺，在注射后3小时～10天内目的基因可于乳汁中高效表达出目的蛋白，产物表达量为～50mg/L。
5.根据权利要求1或4所述高效快速的真核蛋白表达和生产系统，其特征在于所述的处于稳定泌乳期的山羊乳腺为产羔10-20天后。
全文摘要
本发明涉及一种高效快速的真核蛋白表达和生产系统，由两部分组成即山羊乳腺组织特异性表达载体和处于稳定泌乳期的山羊乳腺。其中山羊乳腺组织特异性表达载体质粒pMRPA以特定长度的山羊β－酪蛋白启动子序列为主要元件构成；克隆在该载体中的目的基因，以生理盐水溶液形式，并以直接注射的方式导入处于稳定泌乳期的山羊乳腺后，目的基因产物即可在羊奶中表达，且具有表达快速、水平高、持续时间长的特点。
文档编号C12N15/67GK1514001SQ0311129
公开日2004年7月21日 申请日期2003年3月28日 优先权日2003年3月28日
发明者扈荣良, 徐青, 张守峰 申请人:中国人民解放军军需大学军事兽医研究所, 中国人民解放军军需大学军事兽医研究