专利名称：一种大肠杆菌周质腔分泌型表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠杆菌周质腔分泌型表达载体，更具体地，涉及一种通过在外源蛋白的N端添加PelB信号肽(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAM，(SEQ ID NO1))，并使外源蛋白与FK506结合蛋白类肽酰脯氨酸顺反异构酶共表达，提高外源蛋白在大肠杆菌周质腔中的表达水平的新型表达载体；这种表达载体的构建方法；以及含有该种载体的宿主细胞。
背景技术：
与真核表达体系(如酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞等)相比，原核表达体系(主要是大肠杆菌表达体系)具有许多独特的优点。比如遗传背景清楚、细胞生长迅速、发酵周期短、易于筛选和基因重组操作、表达系统较为丰富等。但是原核表达体系也存在一些缺点如外源蛋白无法糖基化和易于形成包涵体等。外源蛋白形成的包涵体必须经过变性、再折叠复性，才能得到活性蛋白产物。上述过程操作烦琐、复性效率低，对于不同的外源蛋白需要分别进行优化。因此，如果能够采用原核表达体系实现外源蛋白的胞内可溶表达或周质腔分泌表达，那么在实践应用中将会大大提高工作效率，节约生产成本(Swartz JR.et al.，2001)。
人们采取过了多种方式促进外源蛋白的可溶表达。与葡萄球菌蛋白A(SPA)(Abrahmsen L.et al.，1986；Uhlen M.et al.，1989)，谷胱甘肽(GST)(Smith DB.et al.，1988；Sharrocks AD.et al.，1994)或硫氧环蛋白(Thioredoxin)(LaVallie ER.Et al.，2003)融合表达，对部分外源蛋白能够起到促可溶作用；利用蛋白质二硫键形成相关蛋白(Kurokawa Y.et al.，2000，2001；Zhang Z.et al.，2002)、脯氨酰顺反异构酶(Zhang Z.et al.，2003)和其他分子伴侣(Humphereys DP.et al.，1996；)的辅助折叠作用，设计表达载体，能够明显促进外源蛋白的胞内可溶表达。但是，胞内可溶表达方式也具有比较明显的缺点胞内属还原性环境，不利于外源蛋白形成正确的二硫键桥，进而影响正确构像的形成(Ritz D.et al.，2001)；而且需要超声破碎或压力破碎细胞壁才能释放胞内可溶表达组分，不利于大规模培养和纯化。
比较而言，因为周质腔属氧化型环境(Ritz D.et al.，2001)，有利于形成正确的二硫键桥，而且提取周质腔表达组分时不需要破碎细胞壁，能够大幅度降低纯化成本，所以周质腔分泌型表达是一种理想的表达方式。通常将外源蛋白与适当的信号肽融合，借助信号肽的引导作用将外源蛋白分泌到周质腔中。控制表达载体的拷贝数，选择合适的启动子和培养基，采用适当诱导表达方式和培养条件(培养温度、诱导时机和诱导时间)，会改善周质腔分泌型表达的效率(Mergulhao FJ.et al.，2003a，2003b)。
蛋白质在大肠杆菌周质腔中的折叠过程存在着三个主要的晚期事件(Missiakas D.et al.1997)二硫键的形成、脯氨酸的异构化。这些事件分别由蛋白质二硫键形成相关蛋白(如DsbA、B、C、D、E、G等)、脯氨酸顺反异构酶(如FkpA等)催化完成，其效率直接决定了外源蛋白质的周质腔分泌型表达的效率。有实验证明，分泌到周质腔中的外源蛋白有时也形成无活性的包涵体。将周质腔内辅助蛋白折叠的分子伴侣引入到分泌型表达载体中，不仅有利于提高周质腔分泌型表达水平，而且还可以促进外源蛋白的正确折叠，提高表达产物的活性。
本发明人的同事在PET28a+载体(Novagen)的基础上，分别将Dsbc\DsbG(Zhang Z.et al.，2002)或FkpA(Zhang Z.et al.，2002)与外源蛋白融合表达和共表达，明显提高了胞内可溶表达的比例，但是未发现周质腔分泌型表达水平的提高。因此在应用周质腔分子伴侣时，需同其他促进周质腔分泌型表达的方法结合，才能实现高效周质腔分泌型表达。将DsbA与胰岛素前体(pro-insulin)融合表达实现了后者的分泌型表达(WinterJ.et al.，2001)。但是融合表达的外源蛋白需要经过蛋白酶切去除融合的非目的蛋白部分，增加了操作步骤和生产成本，降低生产效率，不利于大规模制备目的蛋白。
发明内容
发明概述本发明创造性地将FkpA引入到大肠杆菌分泌型表达载体的构建中，并采用共表达的方式，对已经添加信号肽的一系列外源蛋白成功进行了周质腔分泌型表达。
因此，本发明的一个方面，提供一种用基因工程方法通过将促折叠相关蛋白FkpA引入到大肠杆菌表达载体上而构建的大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体。
在本发明的另一个方面，提供一种含有用于构建大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体的宿主细胞。
在本发明的另一个方面，提供了一种大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体pFUW802s。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于周质腔分泌型表达抗抗癌胚抗原(CEACarcino Embryonic Antign)单链抗体的表达载体pFUW802s/CEAscFv。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于周质腔分泌型表达人次级淋巴组织趋化因子(hSLCHuman Secondary Lymphoid-tissue Chemokine)的载体pFUW802s/hSLC。
在本发明的另一个方面，提供了一种含有通用的周质腔分泌型表达载体pFUW802s的宿主细胞，所述的宿主细胞优选地为大肠杆菌。
在本发明的另一个方面，提供了一种含有pFUW802s/CEAscFv1、或者pFUW802s/hSLC载体的宿主细胞，所述的宿主细胞优选地为大肠杆菌。
在本发明的另一个方面，提供了一种构建上述各种载体的方法。
在本发明的另一个方面，提供了一种以周质腔分泌型的形式表达外源蛋白的方法，其特征在于利用上述的通用的周质腔分泌型表达载体在本说明书的上下文，尤其是“实施例”部分的公开内容的基础上，本发明的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
图1为大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体pFUW802s的构建过程简图。
图2为用于构建大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体pFUW802s的中间载体pFUW802和pTCEF的简图。
图3为大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体pFUW802s的示意图。
图4为利用本发明所构建的大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体在大肠杆菌中以周质腔分泌型形式表达抗CEA单链抗体的SDS-PAGE图和Western blot图。
A图为SDS-PAGE结果，泳道1蛋白分子量标准；泳道2pFUW802周质腔组分(P组分)；泳道3pFUW802的超声沉淀组分(UD组分)；泳道4pFUW802的超声上清组分(US组分)；泳道5pFUW802/CEAscFv的P组分；泳道6pFUW802/CEAscFv的UD组分；泳道7pFUW802/CEAscFv的US组分；泳道8pFUW802s/CEAscFv的P组分；泳道9pFUW802s/CEAscFv的UD组分；泳道10pFUW802s/CEAscFv的US组分；泳道11pFUW802s的P组分；泳道12pFUW802s的UD组分；泳道13pFUW802s的US组分。粗箭头所指为FkpA，细箭头所指为抗CEA单链抗体。
B图为Western blot结果，泳道1蛋白分子量标准；泳道2pFUW802s/CEAscFv的P组分；泳道3pFUW802s/CEAscFv的UD组分；泳道4pFUW802s/CEAscFv的US组分；泳道5pFUW802/CEAscFvP组分；泳道6pFUW802/CEAscFv的UD组分；泳道7pFUW802/CEAscFv的US组分。
图5为利用本发明所构建的大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体在大肠杆菌中以周质腔分泌型形式表达抗CEA单链抗体的活性分析结果(ELISA分析抗CEA单链抗体的抗原结合特异性)。
图6为利用本发明所构建的大肠杆菌通用的周质腔分泌型表达载体在大肠杆菌中以周质腔分泌型形式表达人次级淋巴组织趋化因子(hSLC)的SDS-PAGE图和Western Blot图。
周质腔分泌型形式表达hSLC的SDS-PAGE和Western blot鉴定。A图为SDS-PAGE结果，泳道1pFUW802/hSLC的P组分；泳道2蛋白分子量标准。泳道3-5不同克隆的pFUW802s/hSLC的P组分。B图为Western blot结果，泳道1蛋白分子量标准；泳道2pFUW802/hSLC的P组分；泳道3pFUW802s/hSLC的P组分。
发明详述在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义本文所述的“促折叠相关蛋白”是指任何与蛋白质的折叠和成熟过程相关联的蛋白质，包括各种分子伴侣蛋白、蛋白质二硫键形成蛋白、蛋白质二硫键顺反异构酶、蛋白质肽酰脯氨酰顺反异构酶等。
本发明采用的促折叠相关蛋白FkpA同时具有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性和分子伴侣的活性(Ramm K.et al.，2000，2001；Bothmann H.et al.，2000；Arie JP.et al.，2001)。FkpA蛋白是大肠杆菌组成型表达的蛋白，其成熟体位于大肠杆菌周质腔中，主要在这一部位发挥作用。但当外源蛋白大量表达时，原本以基础水平表达的FkpA的量显然不能满足如此众多的外源蛋白的折叠要求。通过将FkpA的编码基因克隆到以多拷贝形式存在于大肠杆菌中的质粒上，使得FkpA也能大量表达，从而有效缓解了促折叠相关蛋白的不足，这样就能使大量的外源蛋白得到正确折叠。将促折叠相关蛋白FkpA引入到大肠杆菌周质腔分泌型表达载体上，通过在周质腔中过量表达这种促折叠相关蛋白就能有效地提高外源蛋白的表达水平和起到促进折叠的作用。
本文所述的“共表达”是指外源基因序列与促折叠相关蛋白基因序列可以在同一个转录启动子的控制下转录，但以不同的翻译单元分别翻译成促折叠相关蛋白和外源目的蛋白；外源基因序列与促折叠相关蛋白基因序列也可以在不同的转录启动子的控制下分别转录，并且以不同的翻译单元分别翻译成促折叠相关蛋白和外源目的蛋白。
总之，本发明所提供的载体具有以下特点1.共表达促折叠相关蛋白FkpA，有效促进外源蛋白在周质腔中的正确折叠，提高周质腔分泌型表达水平；2.采用该载体进行周质腔分泌型表达时，不需要破碎细菌细胞壁，直接提取周质腔组分即可以收获目的蛋白。
3.以这种方式表达的蛋白都是有功能的活性蛋白，不需要步骤繁琐而效率极低的变性和复性过程，只需要较为简单的纯化步骤就能得到大量的外源蛋白；4.这种表达载体以大肠杆菌为表达宿主，可大量发酵生产，生产工艺简单，容易操作，成本低廉。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，本说明书中的实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例本发明人所在实验室已经成功构建双功能表达载体(噬菌体展示和表达外源蛋白)pFUW80(张卫国等，遗传学报，1999，26(2).99-106)和pFUW802。本发明采用基因工程方法改建pFUW802，使之具有新的多克隆位点；同时引入促折叠相关蛋白FkpA，使之能够与外源蛋白在同一个转录启动子的控制下进行共表达，最终构建完成大肠杆菌通用周质腔分泌型表达载体pFUW802s。采用酶切方法将抗CEA单链抗体、人淋巴组织趋化因子连入到上述载体中，并转化大肠杆菌HB2151，进行周质腔分泌型表达。采用盐休克的方法提取周质腔蛋白组分，进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定，对抗CEA单链抗体表达产物采用ELISA方法分析抗原结合活性。
实施例1.周质腔分泌型表达载体pFUW802s的构建(构建路线见图1)1.更改双功能表达载体pFUW802的多克隆位点。
按照图1的构建过程，首先设计一对引物(引物15’-GGCCGCGAATTCAAATTCTATTTCGGATCCGGC-3’(SEQ ID NO2)；引物25’-GGCCGCCGGATCCGAAATAGAATTTGAATTCGC-3’(SEQ ID NO3))，两者退火后形成一段双链DNA片段，在该片段的两端均自动形成酶切位点NotI。具体方法如下引物1和引物2各1μl，补加水8μl，在普通的PCR仪上反复进行10次如下反应94℃ 30sec，72℃ 30sec。反应产物直接作为外源片段，用于下述连接反应。
采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取1μg左右的载体pFUW802(具体操作参照试剂盒说明书)，然后进行NotI(大连宝生物技术公司)单酶切反应，37℃2hours。反应混合物组成1μg左右的载体pFUW802(10μl)，2μl 10×缓冲液，1μl NotI，7μl双蒸水。酶切产物经1％琼脂糖电泳后，采用上海申能博彩公司的胶回收试剂盒进行回收大片段。回收片段溶于50μl双蒸水中，用于下述连接反应。
连接反应混合物2μl外源片段，15μl酶切产物，1μl T4 DNA连接酶(大连宝生物技术公司)，2μl 10×T4 DNA连接酶。16℃连接2hours。连接产物用于转化大肠杆菌TOP10(Novagen)。
按照《分子克隆实验指南》(金冬雁，黎孟枫译，1996，科学出版社，)第2版的方法制备大肠杆菌TOP10的感受态细胞。取1μl连接产物加入到100μl感受态细胞中，冰上放置1hr后，42℃热激90sec，然后冰上放置2min，补加800μl LB培养基(10g/l tryptone(购自GIBCO公司，下同)，5g/l yeast extract(购自GIBCO公司，下同)，5g/l NaCl，pH7.5)，37℃孵育1hr。取其中200μl涂LB-A平板(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，15g/l琼脂and 100μg/ml氨苄青霉素，pH7.5)，37℃孵育过夜。
挑取单克隆菌落接种LB-A培养基(10g/l tryptone，5g/l yeast extract，5g/l NaCl，100μg/ml氨苄青霉素，pH7.5)，37℃摇床培养12hr，采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒，PCR鉴定外源片段是否正确插入。PCR方法以pFUW802的通用上游引物(5‘aaattctatttcaaggagacagtcata 3’(SEQ ID NO4))和前述引物2配对，作为引物进行扩增，能够扩出200bp左右的特异带的克隆为阳性克隆，命名为pFUW802r1。PCR反应条件在20μl的扩增体系中加入0.1～1μl质粒DNA(约20～200ng)和上游/下游引物各10pmol，2μl 10× Taq酶缓冲液和2μl 2mM的dNTPs，Taq酶(自制)1U，补水至总体积20μl。在94℃预变性5min后，94℃变性40Sec，退火40Sec，72℃延伸40Sec，扩增25个循环，上样5μl，采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。经过上述过程，pFUW802中的多克隆点和fd噬菌体基因3(fd gene 3)被替换为一段含有一系列酶切位点的核苷酸序列(SEQ ID NO5)代替。该序列及所附酶切位点如下。
NotIEcoRI BamHI NotI~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ ~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~GCG GCC GCTGAA TTCAAA TTC TAT TTCGGA TCCGGC GGC CGCCGC CGG CGACTT AAGTTT AAG ATA AAGCCT AGGCCG CCG GCG2.构建周质腔分泌型表达载体pFUW802s采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取1μg左右的载体pTCEF和pFUW802r1，然后分别进行酶切反应。反应条件如下37℃酶切2hr。反应混合物组成1μg左右的载体(10μl)，2μl 10×缓冲液，1μl EcoRI和1μl BamHI，6μl双蒸水。酶切产物经1％琼脂糖电泳后，采用上海申能博彩公司的胶回收试剂盒进行回收。pTCEF酶切小片段产物(含有核糖体结合位点RBS和FkpA基因序列)和pFUW802r1酶切大片段产物回收后均溶于50μl双蒸水中，用于下述连接反应。
连接反应混合物6μl pFUW802r1酶切大片段产物，20μl pTCEF酶切小片段产物，1μl T4 DNA连接酶(大连宝生物技术公司)，3μl 10×T4 DNA连接酶。16℃连接2 hours。连接产物用于转化大肠杆菌TOP10。转化方法同上。挑取单克隆菌落接种LB-A培养基37℃摇床培养12hr，采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒，由于连入FkpA基因序列后载体的大小较pUW802r1明显变大，采用1％琼脂糖电泳就可以鉴定出阳性克隆。阳性克隆载体即为周质腔分泌型表达载体pFUW802r2。
采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取1μg左右的载体pFUW802和pFUW802r2，然后分别进行酶切反应。反应条件如下37℃酶切2hr。反应混合物组成1μg左右的载体(10μl)，2μl 10×缓冲液，1μl SacII和1μl EcoRI，6μl双蒸水。酶切产物经1％琼脂糖电泳后，采用上海申能博彩公司的胶回收试剂盒进行回收。pFUW802酶切小片段产物(约300bp，含有Plac、核糖体结合位点RBS和PelB信号肽基因序列)和pFUW802r2酶切大片段产物回收后均溶于50μl双蒸水中，用于下述连接反应。
连接反应混合物6μl pUW802r2酶切大片段产物，20μl pFUW802酶切小片段产物，1μl T4 DNA连接酶(大连宝生物技术公司)，3μl 10×T4 DNA连接酶。16℃连接2 hours。连接产物用于转化大肠杆菌TOP10。转化方法同上。挑取单克隆菌落接种LB-A培养基37℃摇床培养12hr，采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒，PCR鉴定外源片段是否正确插入。PCR方法以pFUW802的通用上游引物(5‘aaattctatttcaaggagacagtcata 3’(SEQ ID NO4))和前述引物2配对，作为引物进行扩增，能够扩出300bp左右的特异带的克隆为阳性克隆，命名为pFUW802s。PCR反应条件在20μl的扩增体系中加入0.1～1μl质粒DNA(约20～200ng)和上游/下游引物各10pmol，2μl 10×Taq酶缓冲液和2μl 2mM的dNTPs，Taq酶(大连宝生物技术公司)1U，补水至总体积20μl。在94℃预变性5min后，94℃变性40Sec，退火40Sec，72℃延伸40Sec，扩增25个循环，上样5μl，采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
实施例2.pFUW802s/CEAscFv的构建及抗CEA单链抗体的表达鉴定(SDS-PAGE、Western Blot)和活性分析(ELISA)1.pFUW802s/CEAscFv的构建利用XhoI/EcoRI双酶切反应从本实验室构建的抗CEA单链抗体的胞内可溶表达载体(pTCEF/CEAscFv)中切下抗CEA单链抗体的基因序列，作为以下连接反应的外源片段；对pFUW802s和pFUW802也进行同样的酶切反应，回收大片段后，作为以下连接反应的载体片段。抗CEA单链抗体的基因序列来源于参考文献(Koga H.et al.，1990)。酶切反应混合物1μg左右的载体(10μl)，2μl 10×缓冲液，1μl XhoI和1μl EcoRI，6μl双蒸水。反应条件37℃2hr。酶切产物的回收参照上文。
连接反应混合物6μl pUW802s或pFUW802酶切大片段产物，20μl pTCEF/CEAscFv酶切小片段产物，1μl T4 DNA连接酶(大连宝生物技术公司)，3μl 10×T4 DNA连接酶。16℃连接2 hours。连接产物用于转化大肠杆菌TOP10。转化方法同上。挑取单克隆菌落接种LB-A培养基37℃摇床培养12hr，采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒，由于在连入抗CEA单链抗体基因序列后，载体的大小较pFUW802s或pFUW802明显变大，采用1％琼脂糖电泳就可以鉴定出阳性克隆。阳性克隆载体即为周质腔分泌型表达载体pFUW802s/CEAscFv和pFUW802/CEAscFv。
2.抗CEA单链抗体的表达采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒pFUW802s/CEAscFv、pFUW802/CEAscFv、pFUW802s和pFUW802分别转化大肠杆菌HB2151(购自发玛西亚公司)，涂LB-A平板，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落，接种含5ml SBAG-2％液体培养基(35g/l tryptone，20g/l yeast extract，5g/l NaCl，and 100μg/ml氨苄青霉素，pH7.5，2％葡萄糖)的大试管中，30℃摇床培养过夜，摇床转速250rpm。1/100转接含5ml SBAG-0.1％液体培养基/管(35g/l tryptone，20g/l yeast extract，5g/lNaCl，and 100μg/ml氨苄青霉素，pH7.5，0.1％葡萄糖)的大试管中，30℃摇床培养2-3hr，摇床转速250rpm。监测细菌生长至OD600＝0.8-0.9时，补加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(购自大连宝生物技术公司)至终浓度1mmol/L。继续30℃摇床培养20-24hr，摇床转速250rpm。
3.盐休克法提取大肠杆菌周质腔蛋白组分取1ml菌液1,500g离心20min，收集所有菌体，小心吸除上清，每管添加100μl 1×TES缓冲液(0.2mol/L Tris-HCl pH8.0，0.5mmol/L EDTA，0.5mol/L蔗糖)，混匀后补加150μl冰预冷的1/5×TES，再次混匀，冰上放置30min，进行盐休克渗透，使周质腔蛋白组分渗透出来。12,000g离心10min，保留离心上清，即含有周质腔蛋白组分。使用500μl PBS(8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl调pH至7.4，定容至1升)悬浮离心细胞沉淀，超声破碎菌体后，12,000rpm离心10分钟，离心上清即为超声上清，离心沉淀重悬在500μl PBS中，即为超声沉淀。注意超声上清含有胞内可溶表达组分；超声沉淀含有包涵体表达组分。
4.周质腔蛋白组分的鉴定(SDS-PAGE、Western Blot)上述各种组分(周质腔蛋白组分、超声上清和超声沉淀)被用于l2％SDS-PAGE和Western-blot鉴定。SDS-PAGE电泳的相关步骤如下。
(1)聚丙烯酰胺凝胶的配制浓缩胶5％ 分离胶12％ 分离胶8％ 封口胶30％Acr/Bis(29∶1)(ml)0.56.0 4.00.531.5M Tris-HCl(pH8.8)(ml) - 3.8 3.8-1.0M Tris-HCl(pH6.8)(ml) 0.38 - - 0.510％SDS(ml) 0.03 0.150.15 0.02l0％AP(ml)0.03 0.150.15 0.02TEMED(ml) 0.003 0.006 0.009 0.0012ddH2O(ml)2.14.9 6.90.93(2)样品的处理适量蛋白样品(一般约30μl)与等体积的2×SDS凝胶电泳加样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH6.8，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)混合，沸水浴加热5分钟，冷却备上样。
(3)电泳准备电泳缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，pH8.3，0.1％SDS)。取适量体积的样品上样，恒压90-100V，待样品进入分离胶，恒压120-150V。
(4)染色及脱色采用考马斯亮兰R250染色(0.25g考马斯亮兰R250溶于100ml甲醇-水-冰乙酸溶液中(90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸)，室温染色4-12小时。用甲醇-水-冰乙酸溶液脱色，室温脱色至具有明显条带，凝胶照相分析结果(图3)。
若进行Western blot，样品处理及SDS-PAGE同前，改用预染蛋白分子量标准。据具体操作如下(1)电泳结束后，将凝胶用清水漂洗，放入电转缓冲液中浸泡，剪裁比凝胶稍大的纤维素膜(发玛西亚公司)和较之略小的滤纸一同在电转缓冲液中浸泡。在电转夹上依次加滤纸-凝胶-纤维素膜-滤纸，除净各层间气泡。
(2)电转恒流0.3-0.4A电转1-2hr后，取下纤维膜和凝胶，用TBS(100mmol/L Tris-Cl，0.9％(w/v)NaCl，pH 7.5)洗净纤维膜。
(3)封闭将纤维素膜浸泡在封闭液(2％BSA-TBS)中，轻轻振摇2hr。
(4)添加一抗用TBST(100mmol/L Tris-Cl，0.9％(w/v)NaCl，pH 7.5，0.05-0.1％(V/V)Tween 20)洗膜三次，每次5min。将纤维素膜浸泡在封闭液中(含1×1000稀释的9E10腹水)，轻轻振摇1hr。分泌9E10单克隆抗体的杂交瘤细胞来自ATCC(美国典型培养物收集库，American Type Culture collection)。参考实验手册(抗体工程，第二版，董志伟，王琰主编，北京医科大学与中国协和医科大学联合出版社，2002)制备9E10腹水。
(5)添加二抗洗膜方法如上。将纤维素膜浸泡在封闭液(含1×5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG(R&D公司)中，轻轻振摇1hr。
(6)显色洗膜方法如上。加入DAB(3，3’-diamionbenzidene，Sigma产品)显色液，待显色至理想程度时用清水冲洗，终止反应，充分冲洗后避光保存纤维素膜。实验结果见图4。
5.周质腔蛋白组分的活性分析(ELISA)采用直接ELISA检测周质腔蛋白组分和超声上清中抗体的抗原结合活性。ELISA实验结果见图5。ELISA具体操作如下(1)包被收集丰富表达CEA的结肠癌细胞SW1116(来自美国典型培养物收集库ATCC，American type culture collection)，经过简单超声破碎后，12,000g离心5min，收集上清，经过蛋白浓度定量后，以10μg/ml的浓度进行包被，100μl/孔。包被缓冲液(每升水中加入Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，调pH9.6)，37℃包被1hr。
(2)封闭PBS洗板1-2次后，加入封闭液(PBS中加入4％脱脂奶粉或1％BSA)100μl/孔，37℃封闭1-2hr。
(3)加样PBS洗板三次后，加入倍比稀释(1×，2×，4×，8×)的样品(包括对照)，37℃孵育1-2hr。
(4)添加一抗PBST(在PBS中加入0.05％Tween-20)洗板三次后，以封闭液1∶1000稀释9E10腹水，100μl/孔，37℃孵育1-2hr。
(5)添加二抗PBST洗板三次后，以封闭液稀释HRP标记的羊抗鼠抗体IgG至工作浓度。37℃孵育1-2hr。
(6)显色PBST洗板5次后，按100μl/孔添加显色液(48.6ml0.1M柠檬酸，51.4ml 0.2M Na2HPO4加水至1L，pH5.0，配成底物缓冲液。10ml底物缓冲液中加入4mg OPD即邻苯二胺，15μl 30％H2O2配成显色液)，室温避光显色15-30min。
(7)终止反应按50μl/孔添加终止液(2M H2SO4)。
(8)在490nm读取吸光值。
实施例3.pFUW802s/hSLC的构建及hSLC的表达和鉴定(SDS-PAGE和Western Blot)采用上海申能博彩公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒pTCEF/hSLC。hSLC的基因序列来源于参考文献(Nagira M.et al.，1997)。设计引物(引物15‘ATT CTC GAG ATG AAA AAG AAT ATC GCATTT3’(SEQ ID NO6)；引物25‘TTC GAA TTC TCG GGC CTT TCGGGG TCT GGC TAC GTT C3’(SEQ ID NO7))从该载体上扩增hSLC的基因序列，同时在该序列的两端添加酶切位点XhoI和EcoRI，PCR反应混合物1μl质粒，引物1和引物2各1μl(10pmol)，2μl pfu 10×缓冲液，2μl dNTP(2mmol/L)，0.3μl pfu(1U，购自上海申能博彩公司)，13μl双蒸水。反应条件94℃预变性3min，94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸40sec，共25个循环。PCR产物经过1％琼脂糖电泳回收后(方法同前)，与载体pFUW802s同时进行XhoI/EcoRI双酶切反应。酶切反应条件同前。PCR产物酶切后作为连接反应的外源片段，载体酶切后作为连接反应的载体片段。连接反应条件同前。
连接产物的转化，阳性克隆鉴定，表达和鉴定的方法与实施例2相同。SDS-PAGE和Western blot结果见图6。
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SEQUENCE LISTING<110>北京安波特基因工程技术有限公司<120>一种大肠杆菌周质腔分泌型表达载体<130>I030715<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met20<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>2ggccgcgaat tcaaattcta tttcggatcc ggc 33<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>3ggccgccgga tccgaaatag aatttgaatt cgc 33<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列
<400>4aaattctatt tcaaggagac agtcata27<210>5<211>84<212>DNA<213>人工序列<400>5gcggccgctg aattcaaatt ctatttcgga tccggcggcc gccgccggcg acttaagttt60aagataaagc ctaggccgcc ggcg 84<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>6attctcgaga tgaaaaagaa tatcgcattt30<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>7ttcgaattct cgggcctttc ggggtctggc tacgtt 3权利要求
1.一种表达外源蛋白的周质腔分泌型表达载体，其特征在于含有促折叠相关蛋白的基因和连有信号肽的外源蛋白的基因。
2.权利要求1的表达载体，其特征在于，它是一种共表达载体，其中所述促折叠相关蛋白的基因和所述外源蛋白的基因在同一个转录启动子的控制下，或在不同的转录启动子的控制下。
3.权利要求1的表达载体，其中所述的促折叠相关蛋白是FK506结合蛋白类肽酰脯氨酸顺反异构酶。
4.权利要求1的表达载体，其中所述信号肽是果胶酶信号肽(SEQID NO1)。
5.权利要求1的表达载体，其是pFUW802s。
6.权利要求1的表达载体，其是含有抗癌胚抗原单链抗体基因的pFUW802s/CEA-scFv。
7.权利要求1的表达载体，其是含有人次级淋巴组织趋化因子基因的pFUW802s/hSLC。
8.一种含有权利要求1-7中任何一项所述载体的宿主细胞。
9.权利要求8的宿主细胞，它是大肠杆菌。
10.一种构建权利要求1-7中任何一项所述载体的方法，其包含将促折叠相关蛋白的基因引入到表达载体中的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述促折叠蛋白相关蛋白是FK506结合蛋白类肽酰脯氨酸顺反异构酶，所述表达载体是大肠杆菌表达载体。
12.一种在周质腔分泌表达外源蛋白的方法，其包含在权利要求8或9所述的宿主细胞中利用权利要求1-7任一项所述的表达载体表达所述外源蛋白的基因的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种大肠杆菌周质腔分泌型表达载体pFUW802s，该载体通过在外源蛋白的N端添加果胶酶(PelB)信号肽(SEQ ID NO1)，并使外源蛋白与FK506结合蛋白类肽酰脯氨酸顺反异构酶(FkpA)共表达，提高外源蛋白在大肠杆菌周质腔中表达水平；一种周质腔分泌型表达抗癌胚抗原单链抗体(scFv)的载体pFUW802s/CEA－scFv；一种周质腔分泌型表达人次级淋巴组织趋化因子的载体pFUW802s/hSLC；以及一种含有上述周质腔分泌型表达载体的宿主细胞。
文档编号C12N15/63GK1546670SQ20031011703
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月4日 优先权日2003年12月4日
发明者王祥斌, 黄华樑, 周炳, 赵琦, 赵宝锋, 张众 申请人:北京安波特基因工程技术有限公司