专利名称：一种哺乳动物细胞siRNA表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA表达载体，特别涉及一种用于表达哺乳动物细胞siRNA的载体。
背景技术：
由小分子干涉RNA(small interference RNA，siRNA)阻抑基因表达是近年来发展起来的新方法。它通过外源导入与内源基因同源的双链RNA(dsRNA)来降解目标mRNA，从而导致生物体内特异基因的沉默，所以又称为RNA干涉(RNA interference，RNAi)。RNAi通过关闭特异基因的表达而成为研究基因功能的有力工具，在基因表达调控、缺陷识别及基因性疾病的治疗等方面显出极为重要的应用价值。RNAi的作用机制及相关研究已成为当前国际生物医学界的研究热点，并且被Science评为2001年最重要的成果之一。目前该技术已逐渐从细胞水平的研究转向活体动物的研究，是当今功能基因组研究中最有活力的领域之一，而且还可以与传统的转基因(transgene)和基因敲除(gene knockout)研究手段相结合，进行单基因或多基因功能的研究。
RNAi现象首先于1998年在线虫中发现，这种双链RNA导致的RNA干扰现象随后在植物、果蝇、昆虫、真菌等生物及哺乳动物细胞中也分别发现。关于RNAi的作用机制，目前认为当dsRNA(double-stranded RNA，dsRNA)导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶Dicer识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并形成RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合物)，RISC通过配对识别并继续切割目的mRNA，如此循环，从而使目的基因沉默，产生RNA干扰现象。
虽然siRNA能够有效地使目的基因沉默，但由于RNA合成成本高，易于降解，操作复杂，使得该项技术具有一定的局限性，因此，研究者开始探索基于DNA载体的siRNA表达系统。在哺乳动物细胞系统中，是将带有与siRNA互补的小片段DNA的质粒转染细胞，质粒所携带的RNA polymeraseIII启动子将以小片段DNA为模板，并以连续的4-5个腺嘌呤(thymidines，T)为终止区进行siRNA的合成(Sui et al.，2002；Bogenhagen，et al.，1980)，产生的siRNA将会干扰靶基因的表达。目前已经推出多种用于siRNA表达的克隆载体，如pBS/U6或pSilencer载体(Sui et al.，2002，PNAS，99(8)5515-5520)，用于哺乳动物细胞RNAi瞬时表达检测；pSIREN-RetroQ载体(BD Biosciences Clontech，2000，www.bdbioscience.co)，是一种通过重组腺病毒进行哺乳动物细胞RNAi表达的载体；Matsukura等(2003，Nucleic Acid Research，31(15)e77)建立了用四环素控制的siRNA条件表达载体。以上类似的方法已开始用于在细胞或活体水平上进行基因功能的研究。但对于建立稳定siRNA表达细胞系以及通过显微注射法(即类似于常规转基因小鼠的方法)构建基因沉默小鼠模型来说，各有其一定的局限性，因为通常情况下，外源DNA片段的插入不仅使目的基因的表达发生变化，而且往往由于导入的外源DNA片段的随机插入而导致其它基因的破坏，从而干扰表现型，不能真正反映出目的基因的实际生物学功能。
发明创造内容本发明的目的是提供一种可用于建立哺乳动物稳定siRNA表达细胞系以及基因沉默小鼠模型的哺乳动物细胞siRNA表达载体。
本发明所提供的哺乳动物细胞siRNA表达载体，以线性化状态存在，包括两个或三个LoxP位点、由鼠源磷酸甘油酸激酶(murine phosphoglycerate kinase)基因启动子控制的新霉素(neomycin)抗性基因、U6启动子和为待插入的寡核苷酸准备的两个粘性末端。
所述两个粘性末端中的一个粘性末端为U6启动子的末端序列，其5′突出端序列为AAAC，另一个粘性末端的5′突出端序列为TTTT，如图4所示。
待插入的siRNA片段应具有与所述哺乳动物细胞siRNA表达载体的两个粘性末端分别互补的粘性末端，如图5所示。图5中，*N19-21指siRNA基因内选定的19-21个核苷酸序列；RN19-21是N19-21序列的反向互补序列；**是两个重复序列之间的非靶基因序列，它可以是一个易于鉴定阳性克隆的酶切位点，如NotI，SacI，EcoRI，或SacII，也可以是一些有关文献中报道的9个碱基序列。
本发明结合了基因沉默、基因敲除以及转基因的基本原理构建了一种用于哺乳动物细胞siRNA表达的载体，本发明的哺乳动物细胞siRNA表达载体带有经过修饰后的两个粘性末端(图4)，一个末端可为U6启动子的末端序列，另一个末端可为TTTT，并以线性化的状态存在(图1-5)，易于直接连接用户的双链寡核苷酸(siDNA)片段(图5)(可以应用任何公司用于亚克隆连接的T4 ligase)，转到细胞或动物体中起始下游插入的小片段DNA的转录，在转录后形成一个具发夹结构的双链mRNA。利用本发明的哺乳动物细胞siRNA表达不仅简便易行，省时，而且亚克隆成功率高，是目前利用RNAi技术进行基因功能研究非常有力的研究工具。
本发明的pRNAi-Fneo Easy载体含有带有两个LoxP位点的由鼠源磷酸甘油酸激酶基因启动子控制的新霉素抗性基因片段和U6启动子(也位于两个loxP位点之间)，主要用于(1)哺乳动物siRNA稳定细胞系的建立(见图6)；(2)可以通过重组酶(Cre)将抗性基因以及siRNA表达盒去除，对特定基因的功能在细胞水平上进行双向研究；(3)建立基因沉默小鼠模型，在动物体内进行基因的功能研究，还可以进一步将基因沉默小鼠与含有由特定启动子控制的重组酶表达小鼠进行交配，将新霉素+siRNA表达盒去除，对特定基因的功能在动物体内进行双向研究，即进行进一步确认；(4)在哺乳动物细胞内瞬时转染表达。
本发明的pRNAiD-Fneo Easy载体不仅含有由鼠源磷酸甘油酸激酶基因启动子控制的新霉素抗性基因，而且将U6-RNAi表达盒置于两个LoxP位点之间，所以本载体既可以用于哺乳动物细胞瞬时转染表达以及建立siRNA稳定细胞系，还可以用于建立基因沉默小鼠模型，并且还可以通过将基因沉默小鼠与含有由特定启动子控制的重组酶表达小鼠进行交配，将siRNA表达盒去除，对特定基因的功能在动物体内进行双向研究。
本发明的pRNAi-DELneo Easy载体含有两边带有LoxP位点的由鼠源磷酸甘油酸激酶基因启动子控制的新霉素抗性基因以及U6启动子。该载体不仅用于siRNA的瞬时表达以及siRNA稳定细胞系的筛选，而且方便在一个基因siRNA(基因沉默)稳定细胞系建成后，通过重组酶去除抗性基因，再进行下一个基因RNAi稳定细胞系的建立。因此，既可用于单基因功能的研究，又可以用于双基因协同作用的功能研究，同时可用于建立单基因或双基因沉默药物筛选细胞模型。
图1为pRNAi-Fneo Easy vector的酶切图谱图2为pRNAiD-Fneo Easy vector的酶切图谱图3为pRNAi-DELneo Easy vector的酶切图谱图4为哺乳动物细胞siRNA表达载体用于连接siRNA互补的小片段DNA(寡核苷酸)的部分序列图5为小片段DNA(寡核苷酸)的序列结构示意6用pRNAi-Fneo Easy vector载体构建的稳定表达细胞系(Hela)的RT-PCR结果图7为pEasy-Flox vector的酶切图谱具体实施方式
实施例1、pRNAi-Fneo Easy载体的构建以pEasy-Flox(见图7，图中 表示单一酶切位点)和pBluescript(http//www.stratagene.com/vectors/selection/plasmidl.htm)质粒为基本骨架，用NotI+XhoI将含有新霉素基因和三个LoxP位点的DNA片段连接到pBluescript载体上首先构建了一个基础载体，然后用引物1(5‘-FUP1CAACTGTTGGGAAGGGCGAT-3’)和引物2(5’-TCGAGTCGACAAAAACCGTCTTCGAAGACCCCAAACAAGGCTTTTCTCCAA-3’)通过PCR扩增技术从pBS/U6载体(Sui et al.，2002，PNAS，99(8)5515-5520)上获得含有U6启动子的DNA片段，通过XbaI+SalI酶切位点连接到基础载体上，然后，按照常规方法进行如下操作用CaCl2法转化DH5α大肠杆菌，获得阳性克隆后，再进行质粒提取、BbsI酶切线性化、琼脂糖凝胶纯化，最终得到5400bp的pRNAi-Fneo Easy载体(如图1)。
实施例2、pRNAiD-Fneo Easy载体的购建将pRNAi-Fneo Easy载体用Not1+EcoR1酶切，用Klenow酶平端化后，进行自连，然后用CaCl2法转化DH5α大肠杆菌、质粒提取、BbsI酶切线性化、琼脂糖凝胶纯化，最终得到5730bp的pRNAiD-Fneo Easy载体(如图2)实施例3、pRNAi-DELneo Easy载体的构建将pRNAi-Fneo Easy载体用Sal1+Xho1酶切，用Klenow酶平端化后，进行自连，然后用CaCl2法转化DH5α大肠杆菌、质粒提取、BbsI酶切线性化、琼脂糖凝胶纯化，最终得到5730bp的pRNAi-DElneo Easy载体(如图3)。
实施例4、用pRNAi-Fneo Easy载体构建TIMR(一种新的与癌症有关的细胞因子)稳定细胞系采用常规的方法进行细胞培养、细胞转染以及进行稳定细胞系的筛选，即用磷酸钙法转化Hela细胞，用G418进行筛选，用RT-PCR的方法检测目的片段是否整合到基因组中(如图6，A为空细胞对照；B为TIMR-dsRNA稳定细胞系)，共设计了两对引物，即引物1(Neo1)(Upper)5’-CATAGCCTGAAGAACGAGAT-3’引物2(PU6)(Lower)5’-GCTTTTCTCCAAGGGATAT-3’引物3(PNK 1)(Upper)5’-CAGCTTTTGTTCCCTTTAGT-3’引物4(PNK2)(Lower)5’-CACATGTTCTTTCCTGCGT-3’
权利要求
1.一种哺乳动物细胞siRNA表达载体，以线性化状态存在，包括两个或三个LoxP位点、由鼠源磷酸甘油酸激酶基因启动子控制的新霉素抗性基因、U6启动子和为待插入的siRNA基因准备的两个粘性末端。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述两个粘性末端中的一个粘性末端为U6启动子的末端序列，其5′突出端序列为AAAC，另一个粘性末端的5′突出端序列为TTTT。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于所述待插入的siRNA基因具有与所述哺乳动物细胞siRNA表达载体的两个粘性末端分别互补的粘性末端。
4.根据权利要求3所述的pRNAi-Fneo Easy vector表达载体，其特征在于所述siRNA互补DNA片段的正义链和反义链分别为ATTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNSNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述哺乳动物细胞siRNA表达载体为NotI和EcoRI酶切pRNAi-Fneo Easy vector得到的pRNAiD-Fneo Easyvector。
6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述哺乳动物细胞siRNA表达载体为Sal1+Xho1酶切pRNAi-Fneo Easy vector得到的pRNAi-DElneo Easy。
7.根据权利要求4、5、6所述的表达载体，其特征在于所述哺乳动物细胞siRNA表达载体在哺乳动物细胞和小鼠体内进行基因沉默和沉默靶基因恢复中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种哺乳动物细胞siRNA表达载体，以线性化状态存在，包括两个或三个LoxP位点、由鼠源磷酸甘油酸激酶基因启动子控制的新霉素抗性基因、U6启动子和两个粘性末端。本发明的目的是提供一种可用于建立哺乳动物稳定siRNA表达细胞系以及基因沉默小鼠模型的哺乳动物细胞siRNA表达载体，可在哺乳动物细胞和小鼠体内进行基因沉默和沉默靶基因恢复中应用，从而对基因功能进行双向研究。
文档编号C12N15/85GK1626663SQ200310117340
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者张淑平, 常智杰, 傅新元 申请人:清华大学