专利名称：用农杆菌介导外源基因转化百合的方法
技术领域：
本发明涉及用于生物技术和农业技术领域。特别是一种用农杆菌介导外源功能基因转化百合的方法。
背景技术：
对于植物的遗传转化，目前普遍认为农杆菌介导的方法是较为理想的一种途径，近年来，利用农杆菌将外源基因导入单子叶植物，在方法上和实际应用效果上都取得了突破性进展。百合作为一种重要的单子叶花卉，其遗传转化方面研究甚少。
在对现有技术文献的检索和分析中发现，Watad等在“Microprojectilebombardment-mediated transformation of Lilium longiflorum”，“微粒轰击法介导麝香百合的转化”(Plant cell report，植物细胞通报，1998)一文应用微粒轰击法将报告基因和标记基因导入到百合中。但是，通过农杆菌介导将外源功能基因导入百合基因组并得到稳定遗传的基因工程研究依旧是一片空白。虽然Cohen等(1992)和Simon等(1995)曾先后用实验证实百合可被农杆菌某些株系感染，是农杆菌寄主之一，但其后没有更进一步的研究。至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道，通过农杆菌介导外源功能基因对百合的遗传转化尚未发现成功的实例。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用农杆菌介导外源基因转化百合的方法。使其在百合基因转化最佳受体系统建立的基础上，解决农杆菌介导外源基因的百合遗传转化方面的技术难题，并且方法简单，容易实现。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用农杆菌转化百合鳞茎的方式，并在转化过程中采用液体MS重悬菌体、附加AS(乙酰丁香酮)活化菌体等技术来达到建立农杆菌介导的百合基因遗传转化系统的目的，同时达到提高转化率的效果。
本发明先将百合鳞茎经表面消毒后切成小块放在固定MS培养基上培养，选取末污染的鳞片，并沿四周切伤以形成新鲜创口，用重悬后的农杆菌感染外植体，然后放在共培养基上共培养，放在含有卡那霉素的筛选培养基上选择培养，诱导出抗性不定芽，最后在生根培养基上诱导生根后移栽，得到再生苗和转化的百合植株。
本发明的具体步骤如下①百合鳞茎经过表面消毒，切成3-5mm左右大小的小块，放在MS固定培养基上培养5～7天，使其pH为5.8，选取末污染的鳞片于四周用解剖刀切出新鲜创口，作为农杆菌侵染的外植体备用；②农杆菌离心后用液体MS培养基重悬，同时附加100μM AS，活化处理1-2hr，然后感染外植体10～20分钟，OD600nm≈0.8，放在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/+2，4-D 0.1mg/L固体培养基上共培养5～7天，保持pH为5.8，取出放在MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.1mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素100～120mg/L，保持pH5.8，固体培养基上，每2周转接一次，进行筛选直至分化出不定芽；③当不定芽伸长到1～2cm时切下不定芽，放在MS+NAA 0.2mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素25～50mg/L培养基上，保持pH为5.8，诱导生根；④20～30后，试管苗长至7～8cm进行移栽，先转移到基质中，炼苗一周后于培养室培养至新叶长出，然后转移至温室或大棚栽植直至收获种球。
本发明的方法简单易行，具有实质性特点和显著进步，解决了该技术领域中长期有待解决的农杆菌介导外源功能基因对百合转化的技术难题。用本发明的转化技术可将功能基因导入百合基因组中，从而达到有目的地改良百合某些品种或培育新的品种或品系。与现有技术相比，具有安全性高、转化率较高的优点。同时其培养时间为120～150天，大大缩短了育种周期。
具体实施例方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1实验品种为东方百合，将鳞茎由外至内剥开，用清水冲洗干净，洗衣粉液浸泡30min，然后至无菌操作台消毒75％酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，20％浓度的市售安替福民浸泡15-20min，无菌水冲洗3次，将其切成5mm大小作为外植体备用。
将外植体接种在放在MS(pH5.8)固定培养基上培养5天，选取末污染的鳞片于四周用解剖刀切出新鲜创口，作为农杆菌侵染的材料。
将带有半夏凝集素基因pta的农杆菌离心后用液体MS培养基重悬，同时附加100μM AS，活化处理1～2hr，然后感染外植体20分钟(OD600nm≈0.8)，放在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/+2，4-D 0.1mg/L(pH5.8)固体培养基上共培养5天，取出放在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.1mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素120mg/L(pH5.8)固体培养基上。每2周继代一次，直至分化出不定芽。
当不定芽伸长到1～2cm时切下不定芽，放在MS+NAA 0.2mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素50mg/L(pH5.8)培养基上，诱导生根。20天后，试管苗长至7～8cm，将其从瓶中取出，用清水彻底地冲洗掉培养基，移栽到珍珠岩基质中，浇透水后套袋炼苗一周后于培养室培养至新叶长出，然后转移至温室或大棚栽植直至收获种球。获得转半夏凝集素基因pta的东方百合“西伯利亚”32株。
实施例2实验品种为东方百合，将鳞茎由外至内剥开，用清水冲洗干净，洗衣粉液浸泡30min，然后至无菌操作台消毒75％酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，20％浓度的市售安替福民浸泡15-20min，无菌水冲洗3次，将其切成5mm大小作为外植体备用。
将外植体接种在放在MS(pH5.8)固定培养基上培养7天，选取末污染的鳞片于四周用解剖刀切出新鲜创口，作为农杆菌侵染的材料。
将带有油菜钠氢泵基因nhx的农杆菌离心后用液体MS培养基重悬，同时附加100μM AS，活化处理1-2hr，然后感染外植体15分钟(OD600nm≈0.8)，放在MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/+2，4-D 0.1mg/L(pH5.8)固体培养基上共培养5天，取出放在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.1mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素100mg/L(pH5.8)固体培养基上。2周继代一次，直至分化出不定芽。
当不定芽伸长到1～2cm时切下不定芽，放在MS+NAA 0.2mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素25mg/L(pH5.8)培养基上，诱导生根。30天后试管苗长至7～8cm，将其从瓶中取出，用清水彻底地冲洗掉培养基，移栽到珍珠岩基质中，浇透水后套袋炼苗一周后于培养室培养至新叶长出，然后转移至温室或大棚栽植直至收获种球。获得转油菜钠氢泵基因nhx的东方百合“大元帅”18株。
权利要求
1.一种用农杆菌介导外源功能基因转化百合的方法，其特征在于，采用农杆菌转化百合鳞茎的方式，并在转化过程中采用液体MS重悬菌体、附加乙酰丁香酮活化菌体来达到建立农杆菌介导的百合基因遗传转化系统和提高转化率的效果。
2.根据权利要求1所述的用农杆菌介导外源功能基因转化百合的方法，其特征是，先将百合鳞茎经表面消毒后切成小块放在固定MS培养基上培养，选取末污染的鳞片，并沿四周切伤以形成新鲜创口，用重悬后的农杆菌感染外植体，然后放在共培养基上共培养，放在含有卡那霉素的筛选培养基上选择培养，诱导出抗性不定芽，最后在生根培养基上诱导生根后移栽，得到再生苗和转化的百合植株。
3.根据权利要求1所述的用农杆菌介导外源功能基因转化百合的方法，其特征是，包括如下具体步骤①百合鳞茎经过表面消毒，切成3-5mm左右大小的小块，放在MS固定培养基上培养5～7天，使其pH为5.8，选取末污染的鳞片于四周用解剖刀切出新鲜创口，作为农杆菌侵染的外植体备用；②农杆菌离心后用液体MS培养基重悬，同时附加100μMAS，活化处理1-2hr，然后感染外植体10～20分钟，OD600nm≈0.8，放在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/+2，4-D0.1mg/L固体培养基上共培养5～7天，保持pH为5.8，取出放在MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.1mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素100～120mg/L，保持pH5.8，固体培养基上，每2周转接一次，进行筛选直至分化出不定芽；③当不定芽伸长到1～2cm时切下不定芽，放在MS+NAA0.2mg/L+头孢霉素250mg/L+卡那霉素25～50mg/L培养基上，保持pH为5.8，诱导生根；④20～30后，试管苗长至7～8cm进行移栽，先转移到基质中，炼苗一周后于培养室培养至新叶长出，然后转移至温室或大棚栽植直至收获种球。
全文摘要
一种用农杆菌介导外源功能基因转化百合的方法，采用农杆菌转化百合鳞茎的方式，并在转化过程中采用液体MS重悬菌体、附加乙酰丁香酮活化菌体来达到建立农杆菌介导的百合基因遗传转化系统和提高转化率的效果。先将百合鳞茎经表面消毒后切成小块放在固定MS培养基上培养，选取未污染的鳞片，并沿四周切伤以形成新鲜创口，用重悬后的农杆菌感染外植体，然后放在共培养基上共培养，放在含有卡那霉素的筛选培养基上选择培养，诱导出抗性不定芽，最后在生根培养基上诱导生根后移栽，得到再生苗和转化的百合植株。本发明解决了该技术领域中长期有待解决的农杆菌介导外源功能基因对百合转化的技术难题。具有安全性高、转化率较高的优点。
文档编号C12N15/82GK1563392SQ20041001719
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月25日 优先权日2004年3月25日
发明者唐东芹, 杨学军, 钱虹妹, 黄丹枫 申请人:上海交通大学