专利名称：具有δ的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物编码基因及其应用。具体地，涉及两个具有完整阅读框架的嵌合基因RnD6CA和RnD6CB，其分别由来源于黑茶藨子(Ribesnigrum L.)的三段DNA序列构建而成。本发明还涉及该嵌合基因所编码的具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能的多肽，以及含有该DNA序列的酵母表达载体和植物表达载体、宿主细胞，以及利用该基因分别转化酵母和植物生产γ-亚麻酸的应用。
背景技术：
在脂肪酸代谢过程中，Δ6脂肪酸脱氢酶(Δ6-fatty aciddesaturase，D6D)催化亚油酸(linoleic acid，LA，18:2Δ9，12)的第6位碳原子脱氢形成γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA，18:3Δ6，9，12)[1]。γ-亚麻酸又可通过碳链延长和脱氢作用进一步形成花生四烯酸、前列腺素和白三烯类生理活性物质，这些产物在人的大脑发育、视觉、过敏反应及心血管运动等一系列生理功能中产生重要影响。
作为人体的一种必需的不饱和脂肪酸，γ-亚麻酸对人体具有降血脂、抗脂质过氧化、减肥、抑制溃疡、增强胰岛素、抗血栓性心血管疾病等一系列生物学功能[1，2]。目前，国际上γ-亚麻酸已被作为一种新的维生素-维生素F被研究利用[3]。因而，作为γ-亚麻酸生产中的关键酶——Δ6脂肪酸脱氢酶也亦已被越来越多的研究和利用。迄今为止，Δ6脂肪酸脱氢酶基因已从动物[4]、植物[5]、真菌[6]和线虫[7]等不同生物中克隆获得，并在酿酒酵母[7，8]、番茄[9]、烟草[5，10]、油菜[6，8]和大豆[11]等中成功获得了表达。
在植物中，仅月见草(Oenothera sp.)、琉璃苣(Borago officinalisL.)和黑茶藨子等少数几种植物含有GLA[12]，琉璃苣[5]和月见草[13]的Δ6脂肪酸脱氢酶基因国外已有研究报道，而本专利涉及的两个融合基因是来源于黑茶藨子的Δ6脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。
由于这类基因所编码的是一个蛋白，可采用酿酒酵母表达体系来进行体外表达，但由于该蛋白定位在叶绿体或内质网上，且为一膜蛋白，在体外表达体系中即使表达出来，亦较难分离纯化。故一般采用考察所表达的蛋白对外加底物的催化活性的方法来进行功能鉴定。
在所采用的酿酒酵母表达体系中，受体菌是尿嘧啶缺陷型INVSc I，本身不含LA(亚油酸)和GLA(γ-亚麻酸)，因此，在添加底物亚油酸的条件下，如若在酵母工程菌中检测到催化产物γ-亚麻酸，就可以确定外源基因所编码蛋白在酵母表达体系中获得了表达，对外加底物产生了催化作用。所以酿酒酵母已经作为研究外源的Δ6、Δ12-脂肪酸脱氢酶基因功能性鉴定的最常用、最有效的表达体系，且已有许多成功的研究报道[5，6，7]。脂肪酸的检测主要采用GC/MS(气相色谱-质联用技术)来完成。其原理是通过GC(气相色谱)将不同的脂肪酸组分分离，然后通过MS(质谱)检测器分别对每种组分进行质谱定性分析，从而确定每一种组分的成分及含量的比较成熟的联用分析技术。
植物中，GLA仅存在于月见草(Oenothera sp.)、琉璃苣(Boragoofficinalis L.)和黑茶藨子等少数几种植物中[12]，而这些植物的种子油生产亦成为目前世界上GLA的主要商业来源。利用产油真菌发酵也可提取获得GLA，但通过现有的这些生产方式获得的GLA产量都很低，远远不能满足日益增长的市场需求[13]。因此，利用酿酒酵母或转基因油料作物植株表达外源Δ6脂肪酸脱氢酶来生产γ-亚麻酸具有重要的研究意义和经济价值。
发明内容
本发明提供了两个嵌合基因RnD6CA和RnD6CB，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，这两个嵌合基因是利用来源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)的DNA片段RnD6C和RnD6A，及RnD6C和RnD6B构建而成，所编码的多肽分别如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示(图6和7)。
本发明提供了三个来源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)的DNA片段RnD6C、RnD6A、RnD6B，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO3、SEQ IDNO4和SEQ ID NO5所示。
本发明的另一个目的是提供含嵌合基因RnD6CA、RnD6CB的酵母表达载体，以及利用该表达载体转化的酵母细胞。在转化的酵母细胞中所表达的多肽具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能，可以催化外加底物亚油酸生成γ-亚麻酸。
本发明的又一个目的是提供一种含嵌合基因RnD6CA、RnD6CB的植物表达载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体，例如pBIN19，pBI121，pB221，含DRE和/或ABRE元件的诱导启动子以及用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体。
本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin、Actin等以及植物组织部位特异表达启动子等。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等方式导入植物细胞。
可用于本发明转化的植物宿主为双子叶植物，所述双子叶植物选自由烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻和花生等植物组成的组。
本发明还涉及嵌合基因RnD6CA、RnD6CB在生产γ-亚麻酸中的应用。
图1.嵌合基因RnD6CA的核苷酸序列，SEQ ID NO1。
图2.嵌合基因RnD6CB的核苷酸序列，SEQ ID NO2。
图3.RnD6A片段的核苷酸序列，SEQ ID NO3。
图4.RnD6B片段的核苷酸序列，SEQ ID NO4。
图5.RnD6C片段的核苷酸序列，SEQ ID NO5。
图6.嵌合基因RnD6CA所编码的多肽，SEQ ID NO6，其中划线部分分别为Cytb5功能域和三个His Box功能域。
图7.嵌合基因RnD6CB所编码的多肽，SEQ ID NO7，其中划线部分分别为Cytb5功能域和三个His Box功能域。
图8.嵌合基因RnD6CA/B的酵母表达载体图。
图9.嵌合基因RnD6CB/B的植物表达载体图。
图10.嵌合基因RnD6CA/B在酿酒酵母中表达的总脂肪酸GC-MS分析a)INVSc I酵母菌株脂肪酸组成的GC-MS；b)INVSc I酵母菌株脂肪酸组成和加有LA(亚油酸)、GLA(γ-亚麻酸)标准样品的GC-MS；c)含空载pYES2表达质粒酵母的总脂肪酸GC-MS；d)含空载pYES2表达质粒酵母在添加LA底物诱导后的总脂肪酸GC-MS；e)表达RnD6CA基因的酿酒酵母在添加LA底物诱导后的总脂肪酸GC-MS，红色箭头所指为产物峰；f)产物峰局部放大图(X10)；g)表达RnD6CB基因的酿酒酵母添加LA底物诱导后的总脂肪酸GC-MS，箭头所指为产物峰。
图11.酿酒酵母中RnD6CA/B基因表达催化产物GC-MS分析中MS图谱，aRnD6CA/B的酵母表达催化产物的MS图；bγ-亚麻酸标准品的MS图。
具体实施例方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
实施例1.嵌合基因的构建1.黑茶藨子基因组DNA的制备以北京植物园中种植的黑茶藨子(Ribes nigrum L.)活体植株为材料，取其幼嫩叶片约100mg，于7mL Ep管中加入钢珠(直径5mm)，置于液氮中冷冻20-30min，于漩涡器上高速破碎，反复操作2-3次，至材料完全破碎。加入1-2mL预热的CTAB抽提液(参见“精编分子生物学实验指南”2001，科学出版社，颜子颖，王海林译)。混匀。65℃水浴30min。加入等体积氯仿，轻柔抽提约5min。于12000rpm室温离心10min。取上清，加入1/2体积异丙醇混匀，室温放置10min沉淀DNA。用Tip头将沉淀出的DNA挑出，用70％乙醇中洗涤两次，于70％乙醇中室温放置30min。除去70％乙醇，空气中吹干。溶于适量灭菌ddH2O，-20℃保存。
2.RnD6A、RnD6B、RnD6C DNA片段的克隆设计引物分别从前面所提取的DNA中克隆RnD6A、RnD6B、RnD6CDNA片段(图3，4和5)。所用反应体系如下PCR反应体系(50ul) PCR产物电泳(1％凝胶浓度)后切胶回收目的片段(RnD6A、RnD6B、RnD6C三个目的片段的大小分别为0.22kb，0.22kb和1.1kb)，连入pMD 18-T载体(Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)测序验证。
所用引物分别如下1).RnD6ADNA片段的克隆所用引物正向引物5′-TTGAGCATCATTTGTTCCCTCGATTGCCTCGATGCC-3′(SEQ ID NO8)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCACCCCGGGCAGGTGACAGCTT-3′(SEQ IDNO9)2).RnD6B DNA片段的克隆所用引物正向引物5′-TTGAGCATCATTTGTTCCCAAGATTGCCTCGATGCC-3′(SEQ ID NO10)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCAGCCATAGGTGTTGACAGCTTCCC-3′(SEQID NO11)3).RnD6C DNA片段的克隆所用引物正向引物Hind III5′-CGCGAAGCTTATGGCTAATGCAATCAAGAAGTACATG-3′(SEQ ID NO12)反向引物5′-GGGAACAAATGATGCTCAATTTGG-3′(SEQ ID NO13)3.嵌合基因RnD6CA和RnD6CB的构建利用上面所克隆到的并测序验证的RnD6A、RnD6B、RnD6C片段为模板，利用PCR技术获得嵌合基因RnD6CA和RnD6CB序列，并在两端引入HindIII与Xba I酶切位点，连入pMD18-T，通过测序验证。
具体操作如下1).制备嵌合基因所用RnD6A、RnD6B、RnDD6C片段利用上面实施例1中第2节相同PCR反应体系与PCR程序，分别获得RnD6A、RnD6B、RnD6C片段，通过凝胶电泳(1％凝胶浓度)回收。其中RnD6A片段利用SEQ ID NO8和SEQ ID NO9所示引物序列通过PCR扩增获得；RnD6B片段利用SEQ ID NO10和SEQ ID NO11所示引物序列通过PCR扩增获得；RnD6C片段利用SEQ ID NO12和SEQ ID NO13所示引物序列通过PCR扩增获得。
2)嵌合基因制备A)RnD6CA嵌合基因的制备将RnD6A(片段1)和RnD6C(片段2)片段融合形成RnD6CA嵌合基因(图1)。所用引物序列为
正向引物Hind III5′-CGCGAAGCTTATGGCTAATGCAATCAAGAAGTACATG-3′(SEQ IDNO12)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCACCCCGGGCAGGTGACAGCTT-3′(SEQ ID NO9)B)RnD6CB嵌合基因的制备将RnD6B(片段1)和RnD6C(片段2)片段融合形成RnD6CB嵌合基因(图2)。所用引物序列为正向引物Hind III5′-CGCGAAGCTTATGGCTAATGCAATCAAGAAGTACATG-3′(SEQ IDNO12)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCAGCCATAGGTGTTGACAGCTTCCC-3′(SEQ IDNO11)利用下面PCR反应体系进行PCR融合，以获得嵌合基因融合PCR反应体系(20ul) 全长嵌合基因PCR反应体系(50ul) PCR产物电泳后切胶回收，分别获得RnD6CA和RnD6CB嵌合基因全长片段(约1.3Kb)，连入pMD18-T载体(左端带有HindIII酶切位点，右端带有BamH I酶切位点)，转化大肠杆菌DH-5α(请提供具体来源)保存，同时测序验证。
实施例2.嵌合基因酵母载体的构建从含有嵌合基因RnD6CA和RnD6CB的pMD18-T载体中，利用HindIII与Xba I酶切位点，双酶酶切后获得RnD6CA和RnD6CB基因，定向克隆于酵母表达载体pYES2.0(购自Invitrogen公司)，获得酵母表达质粒pYRnD6CA和pYRnD6CB，转化大肠杆菌DH-5α保存。其载体图谱见图8。
实施例3.嵌合基因在酵母中的表达1.酵母的转化参照Invitrogen公司pYES2 Kit(Cat#V285-20)所述方法，将上述嵌合基因的酵母表达质粒pYRnD6CA和pYRnD6CB(质粒图参见图8)，采用醋酸锂介导转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc I(参照Invitrogen公司pYES2 Kit所述转化方法)(购于Invitrogen公司)，以空载体pYES2.0质粒为对照，获得含有各表达质粒的酵母细胞。
2.酵母转化细胞的诱导表达取含嵌合基因酵母表达质粒转化的酵母单菌落，接种于50ml含2％绵子糖的SC-U培养液中(参照Invitrogen公司pYES2 Kit所述配方)，于摇床上250rpm，28℃培养过夜。然后加入诺纳德P-40(NP-40，购自BBI公司)(终浓度1％)、外源亚油酸底物(购自Sigma公司)(终浓度为0.003％)，以及酵母表达诱导物D-半乳糖(购自Amresco公司)(终浓度为2％)250rpm，22℃培养48h诱导表达。
实施例4.嵌合基因酵母表达产物对Δ6脂肪酸脱氢酶底物催化产物的GC-MS分析1.脂肪酸的提取与甲酯化。
离心收集取诱导后的酵母菌体，去离子水洗涤，50℃烘干。取0.1g酵母粉(在实例3.2中所诱导所获得的酵母经50℃烘干即得)充分研磨，加入5ml 5％KOH-CH3OH(购自Aldtich公司)，70℃水浴5h后，加入HCl酸化至其pH值达2.0。再加入4ml 14％BF3-CH3OH(购自Aldtich公司)溶液，70℃水浴1.5h。加入2ml 0.9％NaCI溶液，混匀后静止片刻。再加入2ml氯仿∶正己烷(V/V 1∶4)抽提，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于100μl乙酸乙酯。
2.终产物GC-MS检测分析实验。
所用GC/MS仪为TurboMass(PerkinElmer公司)，柱子BPX-70，30m×0.25mm×0.25vm，柱温120℃，气化室温度230℃。取1μl终产物上样，分流比10∶1。
3.GC-MS结果分析对比图10a、10b和10c，表明在不添加亚油酸底物条件下，所用酵母工程菌株以及含经诱导的空载pYES2表达质粒酵母中没有出现新的产物峰出现，说明所用酵母工程菌株及空载pYES2表达质粒酵母的总脂肪酸中不含外加底物亚油酸(LA)和催化产物γ-亚麻酸(GLA)。
当添加亚油酸底物，并进行诱导表达时，对照(空载pYES2.O)亦没有产物峰γ-亚麻酸(GLA)的出现(参见图10d)。而pYRnD6CA/B的酵母表达菌被诱导后，外加底物亚油酸(LA)可以被催化生成γ-亚麻酸(GLA)(参见图10e和10g)对比图10e、10f和10g，可以发现在保留时间为7.6分钟时，有一个新的物质生成。，其出峰时间和质谱图与标准品γ-亚麻酸(购自Sigma公司)的峰图及质谱图一致(参见图11a和11b)，确定为γ-亚麻酸。
以上结果证明来源于黑茶藨子的两个嵌合基因RnD6CA/B在酿酒酵母中成功表达，所表达的蛋白可以催化外加底物亚油酸(LA)生成γ-亚麻酸(GLA)。
实施例5.嵌合基因RnD6CA/B植物表达载体的构建RnD6CA/B的植物表达载体的构建按常规分子生物学手段进行(参见“精编分子生物学实验指南”2001，科学出版社，颜子颖，王海林译)。以RnD6CA/B DNA为模板，通过在正向引物(SEQ ID NO12)中引入BamHI位点(将Hind III换为BamH I位点)和反向引物(SEQ ID NO9(RnD6CA)和SEQ ID NO11(RnD6CB))中引入Sac I位点(将Xba I换为Sac I位点)，将其插入pBI121双元表达载体[14]中的CaMV 35S启动子后面，得到一个双元表达载体pRnD6CA/B，其图谱如图9所示。经BamH I和SacI酶切、PCR鉴定插入片段无误后，转入农杆菌LBA4404[15]，经提取质粒，酶切、PCR确认。该表达载体可直接用于植物的转化(参见图9)。
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IB051489-序列表SEQUENCE LISTING<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>具有Δ6脂肪酸脱氢酶功能的嵌合基因及其应用<130>IB051489<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1347<212>DNA<213>人工序列<400>1atggctaatg caatcaagaa gtacatgaca gttgaggagc taaaagtgca taacaagcca60gaggatttgt ggatctctat tcagggtaag gtttacaatg tcactgattg gaaaaaggaa 120cacccaggtg gggatagctc tctcctgaat ctaggtggtc aagatgtcac agatgcattc 180attgcttatc atccaggtac tgcttggcaa tatcttgaca ggttctttac tgggtattat 240ctcaaagatt tcaatgtctc agatgtatcc aaagattata gaaaacttgc atctgagttt 300accaaaatgg gtctttttgc aaagaaaggg catggtgttt tctactcctt ttgtcttggg 360gcattcttgt ttgctgtttg tgtttatggt gttttgtatt ctcaaagttt gtttgtgcat 420ttgtgttgtg gtgggatttt ggggttttta tggatgcaaa gtggttatgc tggtcacgat 480tctgggcatt atcagacaat gtctactcct ttttatacca atttggctca aattcttact 540ggaaattgcc ttagtggtat tagtatggct tggtggaaat ggacccacaa tgctcaccac 600gttgctgtta atagtattga ccatgaccct gatcttcagt acatgccatt ttttgtcctc 660tctcccaaat tgttcaatgg cataacttct cgcttttatg ggaggaagtt ggagtttgat 720gcttttgcta ggttcatggt aagttatcag cattggacat tttatccggt gatgattttt 780gcacgatttt atatgtttgt gcccacgttt tttatgttgc tttcaaagaa aaaagtaccc 840aacagacctt tgaatatagc gggaattatt gtgttctgga tttggtttcc tcttcttgtt 900tcatgccttc ccaattggac tgagaggatg atgtttgtgc tagtgagctt tacagttact 960tcaattcaac acgttacatt ttgtttgaat cactactcgg ctgataatta tatgggacat 1020cctactggga acgattggtt tgagaagcag acaagtggga ctttggacat ttcgtgcccg 1080tcttggatgg attggtttca tggtgggctg caattccaaa ttgagcatca tttgttccct 1140cgattgcctc gatgccagct taggacggtc tctccttttg cgatggagct atgcaagaag 1200
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IB051489-序列表<400>3ttgagcatca tttgttccct cgattgcctc gatgccagct taggacggtc tctccttttg60cgatggagct atgcaagaag cacaatttgc cttataggag tttgtccttt ttggaggcca 120atgtcgcgac cattatgacg ttgaggactg cagccctgca agcgcgcgac ttgtccaacc 180cggttccgaa gaacttgctc tgggaagctg tcacctgccc ggggtga 227<210>4<211>227<212>DNA<213>人工序列<400>4ttgagcatca tttgttccca agattgcctc gatgccagct taggaaggtc tctccttttg60tgaaagagct ttgcaagaaa cacaatttgc cttataggag tttatcattt tttgaggcca 120atgttgcaac cattaagacg ttgaggactg ccgccttgca agctcgcgac ctatccaacc 180ctatttcaaa gaatttgcta tgggaagctg tcaacaccta tggctga 227<210>5<211>1139<212>DNA<213>人工序列<400>5atggctaatg caatcaagaa gtacatgaca gttgaggagc taaaagtgca taacaagcca60gaggatttgt ggatctctat tcagggtaag gtttacaatg tcactgattg gaaaaaggaa 120cacccaggtg gggatagctc tctcctgaat ctaggtggtc aagatgtcac agatgcattc 180attgcttatc atccaggtac tgcttggcaa tatcttgaca ggttctttac tgggtattat 240ctcaaagatt tcaatgtctc agatgtatcc aaagattata gaaaacttgc atctgagttt 300accaaaatgg gtctttttgc aaagaaaggg catggtgttt tctactcctt ttgtcttggg 360gcattcttgt ttgctgtttg tgtttatggt gttttgtatt ctcaaagttt gtttgtgcat 420ttgtgttgtg gtgggatttt ggggttttta tggatgcaaa gtggttatgc tggtcacgat 480tctgggcatt atcagacaat gtctactcct ttttatacca atttggctca aattcttact 540ggaaattgcc ttagtggtat tagtatggct tggtggaaat ggacccacaa tgctcaccac 600gttgctgtta atagtattga ccatgaccct gatcttcagt acatgccatt ttttgtcctc 660tctcccaaat tgttcaatgg cataacttct cgcttttatg ggaggaagtt ggagtttgat 720gcttttgcta ggttcatggt aagttatcag cattggacat tttatccggt gatgattttt 780gcacgatttt atatgtttgt gcccacgttt tttatgttgc tttcaaagaa aaaagtaccc 840aacagacctt tgaatatagc gggaattatt gtgttctgga tttggtttcc tcttcttgtt 900tcatgccttc ccaattggac tgagaggatg atgtttgtgc tagtgagctt tacagttact 960tcaattcaac acgttacatt ttgtttgaat cactactcgg ctgataatta tatgggacat 1020
IB051489-序列表cctactggga acgattggtt tgagaagcag acaagtggga ctttggacat ttcgtgcccg 1080tcttggatgg attggtttca tggtgggctg caattccaaa ttgagcatca tttgttccc1139<210>6<211>448<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Ala Asn Ala Ile Lys Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val1 5 10 15His Asn Lys Pro Glu Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Val Tyr20 25 30Asn Val Thr Asp Trp Lys Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu35 40 45Leu Asn Leu Gly Gly Gln Asp Val Thr Asp Ala Phe Ile Ata Tyr His50 55 60Pro Gly Thr Ala Trp Gln Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr65 70 75 80Leu Lys Asp Phe Ash Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu85 90 95Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly100 105 110Val Phe Tyr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cys Val115 120 125Tyr Gly Val Leu Tyr Ser Gln Ser Leu Phe Val His Leu Cys Cys Gly130 135 140Gly Ile Leu Gly Phe Leu Trp Met Gln Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp145 150 155 160Ser Gly His Tyr Gln Thr Met Ser Thr Pro Phe Tyr Thr Asn Leu Ala165 170 175Gln Ile Leu Thr Gly Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Met Ala Trp Trp180 185 190Lys Trp Thr His Asn Ala His His Val Ala Val Asn Ser Ile Asp His195 200 205Asp Pro Asp Leu Gln Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lys Leu210 215 220Phe Asn Gly Ile Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp225 230 235 240
IB051489-序列表Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro245 250 255Val Met Ile Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Met260 265 270Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Pro Leu Asn Ile Ala Gly275 280 285Ile Ile Val Phe Trp Ile Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro290 295 300Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr305 310 315 320Ser Ile Gln His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tyr Ser Ala Asp Asn325 330 335Tyr Met Gly His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lys Gln Thr Ser340 345 350Gly Thr Leu Asp Ile Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly355 360 365Gly Leu Gln Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg370 375 380Cys Gln Leu Arg Thr Val Ser Pro Phe Ala Met Glu Leu Cys Lys Lys385 390 395 400His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn Val Ala405 410 415Thr Ile Met Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gln Ala Arg Asp Leu Ser420 425 430Asn Pro Val Pro Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Thr Cys Pro Gly435 440 445<210>7<211>448<212>PRT<213>人工序列<400>7Met Ala Asn Ala Ile Lys Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val1 5 10 15His Asn Lys Pro Glu Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Val Tyr20 25 30Asn Val Thr Asp Trp Lys Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu
IB051489-序列表35 40 45Leu Asn Leu Gly Gly Gln Asp Val Thr Asp Ala Phe Ile Ala Tyr His50 55 60Pro Gly Thr Ala Trp Gln Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr65 70 75 80Leu Lys Asp Phe Asn Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu85 90 95Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly100 105 110Val Phe Tyr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cys Val115 120 125Tyr Gly Val Leu Tyr Ser Gln Ser Leu Phe Val His Leu Cys Cys Gly130 135 140Gly Ile Leu Gly Phe Leu Trp Met Gln Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp145 150 155 160Ser Gly His Tyr Gln Thr Met Ser Thr Pro Phe Tyr Thr Asn Leu Ala165 170 175Gln Ile Leu Thr Gly Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Met Ala Trp Trp180 185 190Lys Trp Thr His Asn Ala His His Val Ala Val Asn Ser Ile Asp His195 200 205Asp Pro Asp Leu Gln Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lys Leu210 215 220Phe Asn Gly Ile Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp225 230 235 240Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro245 250 255Val Met Ile Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Met260 265 270Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Pro Leu Asn Ile Ala Gly275 280 285Ile Ile Val Phe Trp Ile Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro290 295 300Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr305 310 315 320Ser Ile Gln His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tyr Ser Ala Asp Asn325 330 335
IB051489-序列表Tyr Met Gly His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lys Gln Thr Ser340 345 350Gly Thr Leu Asp Ile Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly355 360 365Gly Leu Gln Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg370 375 380Cys Gln Leu Arg Lys Val Ser Pro Phe Val Lys Glu Leu Cys Lys Lys385 390 395 400His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Phe Glu Ala Asn Val Ala405 410 415Thr Ile Lys Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gln Ala Arg Asp Leu Ser420 425 430Asn Pro Ile Ser Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Asn Thr Tyr Gly435 440 445<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>8ttgagcatca tttgttccct cgattgcctc gatgcc36<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>9gcggtctaga tcaccccggg caggtgacag ctt 33<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>10ttgagcatca tttgttccca agattgcctc gatgcc36<210>11<211>36<212>DNA
IB051489-序列表<213>人工序列<400>11gcggtctaga tcagccatag gtgttgacag cttccc36<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>12cgcgaagctt atggctaatg caatcaagaa gtacatg 37<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>13gggaacaaat gatgctcaat ttgg 2权利要求
1.一种嵌合基因RnD6CA，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一种嵌合基因RnD6CB，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.权利要求1的嵌合基因RnD6CA所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。
4.权利要求2的嵌合基因RnD6CB所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO7所示。
5.一种表达载体，其特征在于包含权利要求1或2所述的嵌合基因。
6.权利要求5的表达载体，其为酵母表达载体或植物表达载体。
7.权利要求6的表达载体，其中所述植物表达载体选自pBIN19，pBI121，pB221，或含DRE和/或ABRE元件的诱导启动子以及用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体。
8.权利要求5的表达载体，其特征在于还包含启动子，所述启动子选自花椰菜花叶病毒CaMV 35S、Ubiqutin、Actin、或植物组织部位特异表达启动子，所述启动子单独或与其它植物启动子结合使用。
9.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求5的表达载体。
10.权利要求9的宿主细胞，其中所述表达载体是通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射或电穿孔的方式导入。
11.权利要求9的宿主细胞，其为酵母细胞或植物细胞。
12.权利要求11的宿主细胞，其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞，所述植物细胞为烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻或花生的细胞。
13.权利要求1的嵌合基因RnD6CA或权利要求2的嵌合基因RnD6CB在生产γ-亚麻酸中的应用。
全文摘要
本发明利用来源于黑茶藨子(Ribes nigrumL.)DNA中的一个片段RnD6C(1139bp)与另外两个约208bp的片段RnD6A和RnD6B，分别构建成两个具有完整阅读框架的嵌合基因RnD6CA、RnD6CB，将其在酵母表达体系中进行了表达。通过GC－MS分析表明，在酵母中这两个嵌合基因所编码的蛋白可以催化外加底物亚油酸生成γ－亚麻酸，具有Δ
文档编号C12N9/04GK1854298SQ200510011608
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者胡赞民, 陆万香, 胡军, 陈宇红, 尹维波 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所