专利名称：一种用于生产冠菌素的基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体来说，涉及一种用于生产冠菌素的基因工程菌及其构建方法。
背景技术：
冠菌素(Coronatine)C18H25NO4，分子量为319(Ichihara etal，1977)，由一个含氨基酸的冠烷酸(coronamic acid)和一个聚酮结构的冠菌酸(coronafacic acid)两个组分以酰氨键连结而成(Mitchell etal，1994)。最初的文献报到它是一种植物毒素。但最近研究发现冠菌素与植物生长调节物质脱落酸、茉莉酸有类似的功能，而且活性是后两者的数千倍，可作为后两者(较为昂贵，生产上很难推广开)的替代物。且冠菌素属纯天然品，在生产上应用不会对环境造成污染，是一种环境友好型生物调节剂。
冠菌素合成有两种方法，一种是化学合成法(市原获民等，1998)，但目前费用较高，不能工业化生产；另一种是生物合成法，即微生物发酵法。最初市原荻民(1998)用发酵法从250L发酵液中仅得冠菌素60mg。随后一些研究者采用基因工程等生物技术手段将其产量提高到20-40mg/L(Bender et.al，1996；Ullrich，2000)。但生产成本还是比较高，一时难以投入大规模农业生产中。限制其产业化的最重要因素就是缺少高产的优良菌株，因而选育高产冠菌素工程菌具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生产冠菌素的基因工程菌株。
本发明的另一目的在于提供该基因工程菌株的构建方法。
本发明的进一步目的在于提供该基因工程菌的应用。
本发明发明人经过深入研究，获得了一种高产冠菌素的丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)菌株，从而完成了本发明。该菌株已于2005年7月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC1412。
本发明所述基因工程菌的构建方法，包括步骤(1)将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理；(2)筛选冠菌素产量高的基因突变菌株。
本发明所述方法，其中将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理包括步骤a)以丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)为出发菌株在含有卡那霉素的MG培养基上培养；将培养好的出发菌株在摇床上培养；离心，悬浮菌体，浓度为106-107c.f.u.ml-1；b)紫外线预处理；c)亚硝基胍NTG诱变；d)终止反应，离心，将菌体用MG液体培养基重新悬浮。
本发明所述方法，其中筛选冠菌素产量高的基因突变菌株包括步骤a)将步骤(1)所得培养物用无菌水稀释，涂布到含有卡那霉素的MG固体培养基上；将长出的单菌落转接到新的含有卡那霉素的固体培养基上培养；b)初筛将步骤a)所得培养物接种到含有卡那霉素的MG液体培养基中，在摇床上培养；再转接到HSC液体培养基中，在温度16℃-20℃下发酵培养，提取冠菌素；以冠菌素产量进行筛选；c)复筛 将步骤b)所得冠菌素产量高的菌株接种到含有卡那霉素的MG液体培养基中，在摇床上培养，再转接到HSC液体培养基中，在温度18℃发酵培养，提取冠菌素；以冠菌素产量进行筛选。
本发明所述方法详述如下(1)将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理；a)以丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)为出发菌株，在含有卡那霉素的MG培养基上培养；将培养好的出发菌株在摇床上培养，当OD值达到0.7左右；离心，弃去上清液，将所得菌体用pH 7.0的磷酸缓冲液洗4-5遍，悬浮菌体，使浓度为106-107c.f.u.ml-1。
b)紫外线预处理15W灭菌紫外灯，距离33厘米，照射10秒。
c)亚硝基胍NTG诱变取步骤a)菌液1.8ml，加0.2ml 0.1mg/mlNTG，反应10分钟。其中亚硝基胍的配制用少量丙酮助溶后，然后加pH 7.0的磷酸缓冲溶液(缓冲溶液∶NTG丙酮溶液为9∶1，NTG母液浓度1mg/ml)。
d)终止反应用2ml pH 5.6的柠檬酸缓冲液稀释反应液以终止反应，并洗涤2-3次，离心，将沉淀用等体积MG液体培养基(KeanePJ，Kerr A，New PB.1970)重新悬浮。
(2)筛选冠菌素产量高的基因突变菌株a)将步骤(1)所得培养物用无菌水稀释80-120倍，涂布到含有卡那霉素的MG固体培养基上(卡那霉素浓度为5-15μg/mL)，在温度28℃-30℃下培养5-10天，将长出的单菌落转接到新的含有卡那霉素的固体培养基上(卡那霉素浓度为5-15μg/mL)，在温度28℃-30℃条件下培养24-36小时；得到的培养物为突变菌株。
优选地，将步骤(1)所得培养物用无菌水稀释100倍，涂布到MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为28℃条件下培养7-8天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为30℃条件下培养48小时。
b)初筛将步骤a)所得培养物接种到MG(卡那霉素浓度为5-15μg/mL)液体培养基中，在摇床上培养，转接到HSC液体培养基(David，1993)中，在温度18℃发酵培养，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
优选地，将步骤a)所得培养物接种到液体MG培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养约24小时，到OD值达到0.6时，按2％接种量转接到HSC培养基中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上培养7天，提取冠菌素，用高效液相色谱法(Palmer and Bender，1993)测定冠菌素含量，以冠菌素产量进行筛选。
更优选地，将步骤a)所得培养物接种到HSC液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)上，培养条件在20ml试管中盛5ml HSC培养基，倾斜45°固定在摇床上，温度为18℃，转速280rpm/min，培养7天，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
c)复筛将步骤b)所得冠菌素产量比出发菌株高1倍以上的菌株接种到MG(卡那霉素浓度为10μg/mL)液体培养基中，在摇床上培养，转接到HSC液体培养基中，在温度18℃发酵培养，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
优选地，将步骤b)所得冠菌素产量比出发菌株高1倍以上的菌株接种到MG(卡那霉素浓度为10μg/mL)液体培养基中，在摇床上培养，在28℃下培养24小时；再按照2％的接种量接入到装有100mlHSC液体培养的500mL三角瓶中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上发酵培养7天，提取冠菌素，以冠菌素产量进行筛选。
本发明所述的基因工程菌的用途，其特征在于将所述菌株用于冠菌素的发酵生产中。
本发明通过亚销基胍处理出发菌株丁香假单胞菌大豆致病变种，获得突变体，突变新菌株丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412可以提高冠菌素产量，并且高产稳产，产量可达100mg/L，比目前文献报道的最高产量(Ullrich，2000)高2.5倍。从而解决了产量低而不稳的问题。
在用本发明提供的基因工程菌株发酵生产冠菌素的不同阶段，采用不同的培养基MG液体培养基、MG固体培养基、HSC液体培养基，其具体组成如下MG液体培养基甘露醇1％谷氨酸钠 0.2％KH2PO40.05％NaCl 0.02％MgSO4·7H2O0.02％H2O 余量pH7.0MG固体培养基MG液体培养基加1.5％的琼脂。
HSC培养基NH4Cl1.0gMgSO4·7H2O 0.2gKH2PO44.1gK2HPO43.6gKNO30.3g2mM FeCl310mlH2O 890mlpH6.8生物材料保藏说明本发明基因工程菌丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonassyringae pv.glycinea)CGMCC 1412，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市中关村，保藏编号CGMCC1412，保藏日期2005年7月12日。
具体实施例方式
实施例1以丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)为出发菌株在含有卡那霉素(10μg/mL)的MG固体培养基上28℃培养48小时；将培养好的出发菌株接种于MG液体培养基(卡那霉素终浓度为10μg/mL)中，28℃、260rpm摇床培养。当OD值达到0.7左右时，离心，弃去上清液，将所得菌体用pH值7.0的磷酸缓冲液洗4-5遍，悬浮菌体，使菌体浓度为107c.f.u.ml-1；将上述悬浮菌液用15W灭菌紫外灯，距离33厘米，照射10秒；取照射后的菌液1.8ml，加0.2ml 0.1mg/ml NTG，诱变反应10分钟；加入2ml pH 5.6的柠檬酸缓冲液稀释反应液以终止反应，并洗涤2-3次，离心，将沉淀用等体积MG液体培养基重新悬浮；用无菌水稀释100倍，涂布到MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为28℃条件下培养7-8天，将长出的单菌落转接到新的MG固体培养基(含卡那霉素浓度为10μg/mL)平板上，在温度为30℃条件下培养48小时；得到的即为突变体。
将培养好的菌落接种到MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)中，在温度为28℃，转速260rpm/min摇床上培养到OD值达到0.7时，按2％接种量转接到HSC培养基中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上培养7天，提取冠菌素；提取出的冠菌素用色谱淋洗剂甲醇溶解，进行高效液相色谱检测；冠菌素产量为112mg/L的新菌株为丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412。
实施例2
将新菌株丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412接种到MG液体培养基中，在温度为28℃，转速260rpm/min摇床上培养到OD值达到0.7时，再按照2％的接种量接入到装有100ml HSC液体培养的500mL三角瓶中，在温度18℃，转速280rpm/min摇床上发酵培养7天，提取冠菌素，重复三次，冠菌素产量分别为90.1mg/L、84.7mg/L、92.4mg/L。
实施例3将本发明丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC 1412的单菌落接种到装有MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)的试管中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养36小时，为一级种子液；将200ml MG液体培养基(卡那霉素浓度为10μg/mL)分装于三个500ml三角瓶中，将培养好的一级种子液按2％接种量分别接种于上述三个500ml三角瓶中，在温度28℃，转速260rpm/min摇床上培养48小时，为二级种子液；用7L的发酵罐内装5L的HSC培养基，用常规高压热蒸汽灭菌发灭菌后，按2％接种量接种二级种子液，通气搅拌；发酵温度18℃，发酵pH 6.8；发酵时间达到6天时下罐，下罐发酵液以大网格树脂吸附法回收产品，并用丙酮洗脱，经重结晶，得到无色结晶状冠菌素产品，产量为89.9mg/L。
权利要求
1.一种基因工程菌，该菌株为丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)CGMCC 1412。
2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，包括步骤(1)将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理；(2)筛选冠菌素产量高的基因突变菌株。
3.根据权利要求2所述方法，其中将出发菌株用亚硝基胍NTG进行诱变处理包括步骤a)以丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)为出发菌株在含有卡那霉素的MG培养基上培养；将培养好的出发菌株在摇床上培养；离心，悬浮菌体，浓度为106-107c.f.u.ml-1；b)紫外线预处理；c)亚硝基胍NTG诱变；d)终止反应，离心，将菌体用MG液体培养基重新悬浮。
4.根据权利要求2所述方法，其中筛选冠菌素产量高的基因突变菌株包括步骤a)将步骤(1)所得培养物用无菌水稀释，涂布到含有卡那霉素的MG固体培养基上；将长出的单菌落转接到新的含有卡那霉素的固体培养基上培养；b)初筛将步骤a)所得培养物接种到含有卡那霉素的MG液体培养基中，在摇床上培养；再转接到HSC液体培养基中，在温度16℃-20℃下发酵培养，提取冠菌素；以冠菌素产量进行筛选；c)复筛将步骤b)所得冠菌素产量高的菌株接种到含有卡那霉素的MG液体培养基中，在摇床上培养，再转接到HSC液体培养基中，在温度18℃发酵培养，提取冠菌素；以冠菌素产量进行筛选。
5.权利要求1所述的基因工程菌的用途，其特征在于将所述菌株用于冠菌素的发酵生产中。
全文摘要
本发明涉及一种用于生产冠菌素的丁香假单孢菌大豆致病变种(P.syringae pv.Glycinea)基因工程菌株及其构建方法。该工程菌株是利用亚硝基胍诱变处理出发菌株，使其产生基因突变，从而筛选冠菌素产量高的菌株。试验证实本发明基因工程菌株可在发酵温度为18℃的条件下用于工业化发酵生产冠菌素，产量可达84.7mg/L－112mg/L。
文档编号C12N13/00GK1900269SQ200510085280
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者李召虎, 章家长, 段留生, 张明才, 田晓莉, 王保民, 焦睿, 吴惠玲 申请人:中国农业大学