专利名称：纯物理法提取高纯度sod的方法
所属领域本发明涉及一种提取SOD的方法，特别是纯物理法提取高纯度SOD的方法。
背景技术：
SOD即超氧化歧化酶，英文全称Super Oxide Dismutase，它是国际界公认的能够有效清除自由基的酶，是人体中不可缺少的具有特殊生物活性的酶，它能分解自由基，是保护健康细胞不受自由基侵害的安全网，当SOD与自由基相遇时，就会将自由基变成对人体无害的水分子和氧分子，进而提高人体的免疫力，人体中的SOD会随着年龄的增长而减少，为了保持健康，我们就需要从体外摄取SOD，但我们所吃普通食物，由于烹饪、加工和食用后胃酸的破坏，再加之含量极少，我们无法从食物中摄取SOD。
SOD还是一种广泛存在于动植物中的药用酶，在各国医学上有极为广泛的用途。科学研究发现，SOD在防止癌细胞扩散和延缓衰老方面的功效显著，这一研究结果使SOD在医学界引起广泛关注。现有SOD的提取方法，大部分都采用有毒药剂和有毒的有机溶剂，对人们的人身安全造成威胁，同时带来环境污染，而且工艺复杂，成本高，提取的SOD纯度不高，不适宜于大规模生产。
发明内容
本发明的目的即在于克服现有技术的缺点，提供一种成本低，无毒、无害，工艺简单的纯物理法提取高纯度SOD的方法，不使用化学溶剂，可大规模生产。
本发明的目的通过以下技术方案来实现纯物理法提取高纯度SOD的方法，它包括以下步骤(1)溶血热变首先取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照10～15分钟，用于预防疯牛病、禽流感等高致病性传染病的传播，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝15～25∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置1～5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素K、维生素E一种或一种以上的复合维生素保护剂，800～1200转/分搅拌破碎约1小时，在70～80℃水浴或恒温器中热变25～35分钟，速冻，静置1～5小时，除去沉淀物，收集清明滤液；(2)超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；(3)纯化浓缩液在水浴或恒温器中，70～80℃热变15～25分钟后，调PH值为5.5，3～8分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
通过上面的叙述可以看出，本发明具有以下优点采用纯物理法提取，没有化学溶剂，无毒无害，可作为药用、注射用，保证了人身安全，同时保护了环境，工艺简单，成本低廉，可大规模进行工业化生产，制得的SOD纯度高，每毫克比活性高达6000单位。
通过实验证实1、试验材料1.1样品(A)SOD样品市场上购买用沉淀法提取的蓝绿色粉末，人体推荐量为6000μ/人；样品(B)SOD样品由西藏天使藏医科技有限公司用纯物理法提取的蓝绿色粉末，人体推荐量为6000μ/人；1.2实验动物SD种大鼠由国家医药总局四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供(合格证号川实动管质第95000247号)；2、实验方法2.1 150-180g成年大鼠，全雌，随机分为两组，每组20只，样品(A)(B)分别配置成活性为1000μ/M重蒸水溶液，按IMI/100gbw空腹灌胃。分别于灌胃后1小时、2小时、4小时、7小时分批处死大鼠，收集血液进行SOD测试；2.2检测方法SOD测试盒由南京建成生物工程研究所一分所提供；测试方法取血清0.4ml加0.1SDS水溶液，混匀后置37℃水浴30分钟，取出后冰箱冷至4℃，加入KCL0.05ml，充分混匀后放入冰箱4℃冷冻30分钟，取出后以3000转/分离心。10分钟后，取上清液测试，取上清液30μl，分别加入上述2.1中不同时间取的试剂，用旋涡混匀器充分混匀，37℃水浴中恒温40分钟，再加入显色剂，10分钟后蒸馏水调零在752分光光度计波长550mm处比色。
3、实验结果见下表SOD活性测试结果单位Nμ/ml
实验结果表明，两组SOD活力于2小时后在血液中逐渐升高，其中，A组活力在7小时时呈下降，而B组活力7小时后保存较稳定。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例1首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照10分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝15∶1的体积比加入肝素，静置1小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素K的复合维生素保护剂，800转/分搅拌破碎1.1小时，在70℃水浴中热变35分钟，速冻，静置1小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，70℃热变25分钟后，调PH值为5.5，8分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
实施例2首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照15分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝20∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置2小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素K、维生素E的复合维生素保护剂，1000转/分搅拌破碎1小时，在75℃恒温器中热变30分钟，速冻，静置2小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在水浴中，75℃热变20分钟后，调PH值为5.5，5分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
实施例3首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照12分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝25∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素E的复合维生素保护剂，1200转/分搅拌破碎0.9小时，在80℃水浴中热变25分钟，速冻，静置5小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在水浴中，80℃热变15分钟后，调PH值为5.5，3分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
实施例4首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照14分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝18∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置3小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为维生素C保护剂，900转/分搅拌破碎1.05小时，在72℃恒温器中热变32分钟，速冻，静置3小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，78℃热变17分钟后，调PH值为5.5，4分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
实施例5首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照13分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝23∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置4小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素K、维生素E的复合维生素保护剂，1100转/分搅拌破碎约0.95小时，在77℃水浴中热变27分钟，速冻，静置4小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，73℃热变23分钟后，调PH值为5.5，7分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
实施例6首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照11分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝17∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置1.5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为维生素K保护剂，850转/分搅拌破碎1小时，在73℃水浴中热变28分钟，速冻，静置2小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，77℃热变18分钟后，调PH值为5.5，6分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
实施例7首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照15分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝22∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置2.5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为维生素E保护剂，1050转/分搅拌破碎1小时，在76℃恒温器中热变26分钟，速冻，静置3.5小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在水浴中，74℃热变22分钟后，调PH值为5.5，5分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
权利要求
1.纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)溶血热变首先取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照10～15分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝15～25∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置1～5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素K、维生素E一种或一种以上的复合维生素保护剂，800～1200转/分搅拌破碎约1小时，在70～80℃水浴或恒温器中热变25～35分钟，速冻，静置1～5小时，除去沉淀物，收集清明滤液；(2)超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；(3)纯化浓缩液在水浴或恒温器中，70～80℃热变15～25分钟后，调PH值为5.5，3～8分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
2.根据权利要求1所述的纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照10分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝15∶1的体积比加入肝素，静置1小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素K的复合维生素保护剂，800转/分搅拌破碎1.1小时，在70℃水浴中热变35分钟，速冻，静置1小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，70℃热变25分钟后，调PH值为5.5，8分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
3.根据权利要求1所述的纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照15分钟在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝20∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置2小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素K、维生素E的复合维生素保护剂，1000转/分搅拌破碎1小时，在75℃恒温器中热变30分钟，速冻，静置2小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在水浴中，75℃热变20分钟后，调PH值为5.5，5分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
4.根据权利要求1所述的纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照12分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝25∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素C、维生素E的复合维生素保护剂，1200转/分搅拌破碎0.9小时，在80℃水浴中热变25分钟，速冻，静置5小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在水浴中，80℃热变15分钟后，调PH值为5.5，3分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
5.根据权利要求1所述的纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照14分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝18∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置3小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为维生素C保护剂，900转/分搅拌破碎1.05小时，在72℃恒温器中热变32分钟，速冻，静置3小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，78℃热变17分钟后，调PH值为5.5，4分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
6.根据权利要求1所述的纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照13分钟在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝23∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置4小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为包含维生素K、维生素E的复合维生素保护剂，1100转/分搅拌破碎约0.95小时，在77℃水浴中热变27分钟，速冻，静置4小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，73℃热变23分钟后，调PH值为5.5，7分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
7.根据权利要求1所述的纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照11分钟在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝17∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置1.5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为维生素K保护剂，850转/分搅拌破碎1小时，在73℃水浴中热变28分钟，速冻，静置2小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在恒温器中，77℃热变18分钟后，调PH值为5.5，6分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
8.根据权利要求1所述的纯物理法提取高纯度SOD的方法，其特征在于它包括以下步骤首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照15分钟，在此血液中按新鲜血液∶抗凝剂＝22∶1的体积比加入抗凝剂，抗凝剂为肝素，静置2.5小时后，倒去上层血清，在红细胞中加入1倍体积的维生素保护剂，维生素保护剂为维生素E保护剂，1050转/分搅拌破碎1小时，在76℃恒温器中热变26分钟，速冻，静置3.5小时，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经截留分子量为6000的中孔纤维超滤机不断加入冻纯水，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液在水浴中，74℃热变22分钟后，调PH值为5.5，5分钟后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。
全文摘要
本发明公开了纯物理法提取高纯度SOD的方法，首先溶血热变取新鲜动物血液为原料，用钴60辐照10～15分钟，再加入肝素作为抗凝剂，静置，倒去上层血清，在红细胞中加入维生素保护剂，搅拌破碎，热变，速冻，静置，除去沉淀物，收集清明滤液；超滤浓缩将清明滤液经中孔纤维超滤机，除去小分子杂质后再经浓缩得浓缩液；纯化浓缩液热变后，调pH值后速冻离心，超滤浓缩，即得高纯度SOD。本发明具有以下优点采用纯物理法提取，没有化学溶剂，无毒无害，可作为药用、注射用，保证了人身安全，同时保护了环境，工艺简单，成本低廉，可大规模进行工业化生产，制得的SOD纯度高，每毫克比活性高达6000单位。
文档编号C12N9/08GK1884504SQ20061002124
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月26日 优先权日2006年6月26日
发明者陈颖敏 申请人:陈颖敏