专利名称：一种非病毒基因转染载体及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属非病毒基因载体的制备与应用，涉及载基因的壳聚糖-脂肪酸嫁接物胶团的制备条件及其基因转染能力。
背景技术：
基因治疗是以基因转移为基础，将外源基因导入人体，达到治疗目的的一种治疗方法。目前基因治疗的首要问题是如何选择合适的基因导入系统。一般地，基因导入系统可分为病毒载体(viral vector)系统和非病毒载体(non-viralvector)系统。病毒载体充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性而被广泛有效地应用。但目前研究应用的病毒载体仍存在诸多不足，如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、制备较复杂及费用较高等。病毒性基因载体所导致的机体严重免疫炎症反应，致使目前的基因治疗研究陷入困境。基因载体研究已经成为解决现存问题，实现基因临床有效、安全治疗的关键。
脂质体由于具有与细胞膜类似的磷脂双分子层结构，可通过吸附、脂交换、融合、内吞等作用促进所包裹的药物进入细胞。而以阳离子脂质为主要材料制成的阳离子脂质体，能够与荷负电的DNA发生缩合，形成脂质体-DNA复合物，利用脂质体经细胞膜转运的能力，使DNA能够进入细胞并表达，是目前研究的比较广泛的一种非病毒载体，但脂质体在体内外的不稳定性及其较大的细胞毒性作用限制了阳离子脂质体的进一步应用。
近年来，许多科学家致力于具有非免疫原性和密接功能的阳离子聚合物类非病毒基因载体研究。这些聚合物多为通过化学合成的多氨基结构，包括聚氨基酸和多聚乙酰亚胺等，这些研究存在的问题是低浓度时转染效率低，而高浓度时存在明显的细胞毒性。
具有氨基结构、安全低毒，并具有体内抗核酶作用的壳聚糖(chitosan，CS)，是最近颇受人们关注的聚阳离子可生物降解材料。研究显示，这种材料在细胞毒性、密接DNA产物粒径大小控制等方面，具有其独特的优势；尽管采用了包括转铁蛋白配体修饰、聚乙二醇(PEG)嫁接等关键技术，但转染效率不高的问题依然存在。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种非病毒基因转染载体，具体的是可包载治疗基因的壳聚糖-脂肪酸嫁接物胶团，该胶团在溶液中壳聚糖-脂肪酸嫁接物浓度超过临界胶团浓度时可自发形成，粒径为20-200nm。
壳聚糖-脂肪酸嫁接物胶团的组成为平均分子量1.5kD～51kD的壳聚糖与(C10～C22的脂肪酸)脂肪酸嫁接得到，嫁接物中壳聚糖的氨基取代度为1％～50％，临界胶团浓度为0.01～0.1mg/ml。具有亲水性与亲油性。
本发明的另一个目的是提供上述壳聚糖-脂肪酸嫁接物胶团的制备方法，通过以下方案实现(1)壳聚糖-脂肪酸嫁接物的合成取平均分子量分别为1.5～51kD的壳寡糖，精密称定，加蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量的碳二亚胺，搅拌溶解。按照壳聚糖脂肪酸(摩尔比)1∶1～1∶100，称取脂肪酸溶于乙醇溶液中。将上述两种溶液混合，在400r·min-1磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5小时后，降至室温(25℃)继续搅拌6小时至反应液澄清。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的脂肪酸，得壳寡糖-脂肪酸嫁接物。
(2)负载治疗基因的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团的制备取上述具有不同平均分子量与氨基取代度的壳聚糖-硬脂酸嫁接物，加水溶解，制备成胶团溶液，水浴超声15分钟，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤以除菌。用25mM的Na2SO4溶液配制质粒DNA溶液，将胶团溶液和质粒DNA溶液按照N/P比(壳聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116)混合，产物置室温25分钟以进一步促进胶团/质粒DNA复合纳米颗粒的形成。
(3)将绿色荧光蛋白质粒DNA与壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液按照N/P比(壳聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116的结合，得到载药胶团，其粒径为100-300nm，表面电位为+30～-20mV。
嫁接物所用的脂肪酸，选自碳链长度C10～C22的饱和与不饱和脂肪酸中的任一种，如癸酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和山萮酸等。
本发明的第三个目的是提供壳聚糖-脂肪酸嫁接物胶团在基因转染中的应用。通过以下方案实现(1)A549细胞的培养取人II型肺上皮细胞A549，在含有10％小牛血清培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔2×105个细胞的密度接种24孔培养板，孵箱内预培养24小时。
(2)嫁接物-pEGFP胶团体外转染转染前24小时内，将A549细胞按2×105/孔接种于24孔细胞培养板中，置37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养至80-90％融合。转染时，吸弃前一天铺制的细胞板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入嫁接物-pEGFP复合纳米粒混悬液以及事先调至一定pH的无血清或含10％FBS的DMEM培养基至终体积0.5ml，继续培养6小时；换用完全培养基，继续培养至72h。
(3)体外转染细胞的荧光值和转染效率测定将细胞从培养板上消化下来，加入一定量的PBS分散，然后超声破碎细胞，用荧光分光光度测定荧光值(激发波长488nm，发射波长508nm，狭缝5nm)。
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，再将细胞从培养板上消化下来，用一定量的PBS分散后，用流式细胞仪测定转染效率。
以壳聚糖-脂肪酸嫁接物为载体转染pEGFP，其对A549细胞的转染效率为15％，转染的特点是转染细胞后外源基因开始表达较慢，但总表达时间较长，可多次传代，转染效率与目前常用的阳离子脂质体相当，但细胞毒性明显低于阳离子脂质体。
由于该载体毒性低、转染效率确切，其比较适合的细胞转染条件是在37℃、pH7.2～7.4含有10％血清的培养液中，与体内的生理环境比较接近，因此具有作为体内基因转染研究的应用价值。
本发明的有益之处是本发明将含羧基的疏水性物质脂肪酸(stearic acid，SA)与壳寡糖分子结构中的部分氨基嫁接，不仅改善了壳寡糖分子结构的疏水性，而且该嫁接物保留了适当数量的氨基，可作为一种阳离子型的载体。这种低毒新型的阳离子聚合物胶团具有快速透过细胞膜、很少被细胞内溶酶体破坏、并靶向细胞核的功能。并通过自身的阳离子特性、进一步密接荷负电的生物大分子，可形成胶团/DNA复合体给药系统。为开发高效安全的基因非病毒类载体的提供新思路。
图1为不同N/P比例的pEGFP-嫁接物胶团的粒径与电位。
图2为不同pH条件下pEGFP-嫁接物胶团的细胞转染结果。
图3为载pEGFP基因的嫁接物胶团或脂质体转染后不同时间细胞内的荧光表达量。
图4为载pEGFP基因的嫁接物胶团或脂质体转染A549细胞的转染效率。
具体实施例方式
本发明通过实施例作进一步的说明。
实施例1一种壳聚糖-脂肪酸嫁接物的合成方法取平均分子量分别为1.5、10、19、51kD的壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量的碳二亚胺(EDC)(表1)，搅拌溶解。按照壳聚糖硬脂酸(摩尔比)1∶100，称取硬脂酸溶于20mL乙醇溶液中。将上述两种溶液混合，在400r·min-1磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5h，5h后维持室温(25℃)，继续搅拌6h至反应液澄清。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48h。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去处残留的硬脂酸，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定。取不同量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的重蒸水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定氨基取代度，结果见表1。
采用芘荧光法测定壳寡糖-硬脂酸的临界聚集浓度。制备不同浓度壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7×10-7mol·L-1)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在396nm和465nm荧光强度，并以测定I396/I465倾斜率的突然变化确定临界胶团浓度。
表1 不同平均分子量壳聚糖与硬脂酸嫁接的理化性质
由结果可知，通过增加嫁接反应中壳寡糖分子量，产物的氨基取代度见效，而嫁接物的临界临界胶团浓度增大，因此可以通过控制壳聚糖分子量，反应得到具有不同特性的嫁接物。
实施例2第2种壳聚糖-脂肪酸嫁接物的合成方法取平均分子量分别为19kD的壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入碳二亚胺1.2g，搅拌溶解。按照壳聚糖脂肪酸(摩尔比)1∶20，分别称取脂肪酸(肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸其中任一种)，溶于20mL乙醇溶液中。将上述两种溶液混合，在400r·min-1磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5h，5h后维持室温(25℃)，继续搅拌6h至反应液澄清。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48h。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去处残留的脂肪酸，得壳寡糖-脂肪酸嫁接物。
分别采用实施例1中三硝基苯磺酸法、芘荧光法测定测定氨基取代度与临界聚集浓度，结果见表2。
表2 壳聚糖与不同脂肪酸嫁接的理化性质
由以上结果可知，以相同的投料比制备的不同脂肪酸与壳聚糖嫁接物，随着脂肪酸碳链长度的增加，产物的氨基取代度与临界聚集浓度均略有减小；所形成的胶团大小与脂肪酸碳链长度有关，碳链越长，胶团的粒径越小。
实施例3第3种壳聚糖-脂肪酸嫁接物的合成取平均分子量分别为19kD的壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量的碳二亚胺(表3)，搅拌溶解。按照壳聚糖脂肪酸(摩尔比)1∶1、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100，称取硬脂酸，溶于20mL乙醇溶液中。将上述两种溶液混合，在400r·min-1磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5h，5h后维持室温(25℃)，继续搅拌6h至反应液澄清。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48h。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去处残留的硬脂酸，得具有不同氨基取代度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
分别采用实施例1中三硝基苯磺酸法、芘荧光法测定测定氨基取代度与临界聚集浓度，结果见表2。
表3 具有不同氨基取代度的壳聚糖-硬脂酸嫁接的理化性质
实验结果表明，随着壳聚糖链上氨基被硬脂酸取代的数量增加，产物在水中的临界聚集浓度减小，得到的胶团粒径也减小。
实施例4负载治疗基因的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团的制备取上述具有不同平均分子量与氨基取代度的壳聚糖-硬脂酸嫁接物，加水溶解，制备成胶团溶液，水浴超声15min，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤以除菌。用25mM的Na2SO4溶液配制pEGFP(绿色荧光蛋白质粒DNA)溶液(500μg/mL)。将胶团溶液和绿色荧光质粒DNA溶液按照N/P比(壳聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116)混合，产物置室温25min以进一步促进胶团/质粒DNA复合纳米颗粒的形成。
取制备的混悬液适量，并以去离子水适当稀释后，用微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定粒径及表面电位。结果见表2。
表2 负载治疗基因的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团的理化性质
由以上结果可知，当嫁接物胶团与pEGFP质粒DNA形成复合物胶团后，粒径有所增大，说明嫁接物胶团与pEGFP质粒DNA形成复合物是通过多个嫁接物胶团对pEGFP质粒DNA包裹和密接，但其粒径与pEGFP质粒DNA在溶液中的粒径相当。
实施例5将一定量的嫁接物制备成不同浓度的胶团溶液，水浴超声15min，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤以除菌。用25mM的Na2SO4溶液配制pEGFP溶液(500μg/ml)。将胶团溶液和质粒DNA溶液按照N/P比(壳聚糖的氨基/DNA的磷酸基)1∶0.5-1∶116)混合，产物置室温25min以进一步促进胶团/质粒DNA复合纳米颗粒的形成。
参见图1，是不同N/P的胶团在去离子水中的粒径和电位。从图中可以看出随着N/P的增强，电位逐渐增大，从-10.2mV上升到+40.8mV，随N/P的增加变化较大；而粒径刚开始有上升的趋势，当电位接近零时，粒径最大，这与电位绝对值变小有关，使得粒子间聚集；然后粒径慢慢降为最小值，这与载体致密压缩DNA有关。
实施例6载-pEGFP基因的嫁接物胶团的细胞转染1、A549细胞的培养取人II型肺上皮细胞A549，在含有10％小牛血清培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔2×105个细胞的密度接种24孔培养板，孵箱内预培养24小时。
2、嫁接物-pEGFP胶团体外转染转染前24小时内，将A549细胞按2×105/孔接种于24孔细胞培养板中，置37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养至80-90％融合。转染时，吸弃前一天铺制的细胞板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入嫁接物-pEGFP复合纳米粒混悬液以及事先调至一定pH的无血清的DMEM培养基至终体积0.5ml，继续培养6小时；换用完全培养基，继续培养至72h。
3、体外转染细胞的荧光显微镜观察和荧光值测定将培养板直接置倒置荧光显微镜下于不同时间进行观察，拍照后吸去培养液，PBS洗涤2次，再将细胞从培养板上消化下来，用一定量的PBS分散，然后超声破碎细胞，用荧光分光光度测定荧光值(激发波长488nm，发射波长508nm，狭缝5nm)。
培养液的pH对嫁接物转染的影响参见图2。当pH从6.5上升到7.0，转染效率增加，而当pH从7.0增加到7.5时，转染效率下降。但7.0和7.2相差不是很大，并考虑到体内pH为7.4，而且一般的培养液(DMEM)都在7.2左右，所以在pH7.2～7.4进行细胞转染效果较好。
实施例7载-pEGFP基因的嫁接物胶团的细胞转染按照实施例4所述的细胞转染实验方法，以脂质体LipofectamineTM2000做对照。在转染条件相同的情况下(PH7.2无抗生素无血清DMEM培养液，每孔1μg pEGFP)，进行嫁接物-pEGFP体外转染试验。
不同时间，嫁接物-pEGFP(N/P58)复合纳米粒与脂质体-pEGFP纳米粒转染后的细胞内荧光蛋白含量参见图3。结果显示嫁接物的荧光峰值比脂质体低，但脂质体24h后荧光开始减退，随着时间的延长荧光越来越弱，而嫁接物的荧光有持续增长的趋势，这可能是因为它进入细胞内后首先要在多糖消化酶类的作用下被降解后，才能逐渐释放出所携带的DNA，因此它转染细胞后外源基因开始表达较慢，但总表达时间较长，经多次传代、在荧光显微镜下观察，嫁接物对应的阳性细胞的表达可至少持续4周，嫁接物介导的细胞荧光长时间表达的特性，可能对减少给药频率，提高生物利用度非常有利。
实施例8载-pEGFP基因的嫁接物胶团的细胞转染按照实施例4所述的细胞转染实验方法，以脂质体LipofectamineTM2000做对照。改变转染条件，在pH7.2的DMEM培养液中加入10％(W/W)的血清，进行嫁接物-pEGFP体外转染试验。
转染效率的测定将培养板取出后，吸去培养液，PBS洗涤2次，再将细胞从培养板上消化下来，用一定量的PBS分散后，用流式细胞仪测定转染效率。
流式测定染效率参见图4，图中Contral空白对照，A无载体，B嫁接物胶团，C脂质体。结果显示，嫁接物介导(N/P58)的细胞转染效率为15％，脂质体LipofectamineTM2000的转染效率为21％。
由于血清中的某些成分会与阳离子脂质发生作用，增加了其粒径，从而减少与细胞膜的接触面积，增加了内吞进入细胞的难度，降低内吞的药物量，故早期的转染试剂均要求无血清培养。
实验发现脂质体-pEGFP复合物在有血清存在的条件下转染效率降低，由荧光值初步测定发现，当有10％血清存在时，脂质体-pEGFP复合物相对应的荧光值降低了46％；嫁接物-pEGFP相对应的荧光值并未下降，相反有所增加(10％)，转染效率的促进作用可能是血清增加了细胞活性，而含10％血清的培养基更接近体内环境，所以嫁接物胶团可能比脂质体更适合体内应用。
细胞毒性实验采用四唑盐比色法考察载基因嫁接物胶团的细胞毒性。2×105个/孔的A549细胞接种于24孔培养板，37℃，CO2孵箱培养24h，待细胞贴壁后，每孔中加入不同量嫁接物-pEGFP，分别作用48h后，每孔加MTT溶液100μL(5mg·mL-1)，继续培养4h，弃上清，每孔加二甲基亚砜600μL，酶联免疫测定570nm处各孔吸光度(A)，以培养基为空白对照并与脂质体LipofectamineTM2000相比较，取平均值，按(1)式计算细胞存活率细胞存活率(％)＝A570(样品)/A570(对照)×100％ (1)其中A570(样品)为加入载体后的细胞的吸光度，A570(对照)为空白对照的细胞的吸光度。
嫁接物和脂质体LipofectamineTM2000介导细胞转染的细胞毒性结果显示在两者转染效率相当的载体用量情况下，嫁接物(N/P58)介导细胞转染后的存活率为90％左右，约是脂质体(2μg)转染后细胞存活数的1.5倍。说明嫁接物的细胞毒性明显小于脂质体LipofectamineTM2000。
权利要求
1.一种非病毒基因转染载体，其特征是由平均分子量1.5kD～51kD的壳聚糖与C10～C22的脂肪酸嫁接形成壳聚糖-脂肪酸嫁接物胶团，临界胶团浓度＜0.1mg/ml，当在溶液中浓度超过临界胶团浓度时，可自发形成胶团，粒径介于20-200nm，胶团表面带正电荷。
2.根据权利要求1所述的非病毒基因转染载体，其特征是所述的嫁接物胶团中壳聚糖的氨基取代度为1％～50％。
3.根据权利要求1所述的非病毒基因转染载体，其特征是嫁接物所用的脂肪酸，选自碳链长度C10～C22的饱和与不饱和脂肪酸中的任一种。
4.根据权利要求3所述的非病毒基因转染载体，其特征是嫁接物所用的脂肪酸选自癸酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和山萮酸中任一种。
5.根据权利要求1所述的非病毒基因转染载体的制备方法，其特征是通过以下方案实现(1)壳聚糖-脂肪酸嫁接物的合成取壳寡糖，加蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量的碳二亚胺，搅拌溶解，按摩尔比为壳聚糖∶脂肪酸＝1∶1～1∶100，称取脂肪酸溶于乙醇溶液中，将上述两种溶液混合，在磁力搅拌下，80℃恒温反应5小时后，降至室温，继续搅拌6小时至反应液澄清，蒸馏水透析48小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的脂肪酸，得壳寡糖-脂肪酸嫁接物；(2)负载治疗基因的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团的制备取步骤(1)的壳聚糖-硬脂酸嫁接物，加水溶解，制备成胶团溶液，水浴超声15分钟，微孔滤膜过滤，用Na2SO4溶液配制质粒DNA溶液，将胶团溶液和质粒DNA溶液按照N/P比为1∶0.5-1∶116的比例混合，产物置室温25分钟；(3)将绿色荧光蛋白质粒DNA与壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液按照N/P比为1∶0.5-1∶116的比例结合，得到载药胶团，其粒径为100-300nm，表面电位为+30～-20mV。
6.根据权利要求5所述的非病毒基因转染载体的制备方法，其特征是获得是嫁接物胶团能够通过其表面的正电荷与带负电的DNA结合，形成稳定的载DNA嫁接物胶团。
7.权利要求6所述的非病毒基因转染载体的制备方法，其特征是载DNA嫁接物胶团中，壳聚糖的氨基与DNA的磷酸基的比例为1∶0.5～1∶116。
8.权利要求1所述的非病毒基因转染载体，在基因转染中的应用。
9.权利要求1所述的非病毒基因转染载体，其特征是在制备形成胶团/DNA复合体给药系统中应用。
全文摘要
本发明提供一种非病毒基因转染载体，由平均分子量1.5kD～51kD的壳聚糖与C
文档编号C12N15/63GK1844402SQ20061005051
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月26日 优先权日2006年4月26日
发明者胡富强, 杜永忠, 袁弘, 游剑, 应晓英, 赵梦丹 申请人:浙江大学