专利名称：旋毛虫70KDa热休克蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明为一种旋毛虫新抗原基因热休克蛋白基因，含有该基因的 栽体的构建及原核表达载体，以及所表达的蛋白及由蛋白免疫动物产 生的抗体。本发明还涉及所述基因和蛋白的应用。
背景技术：
旋毛形线虫(7Wc/ // e/7fl "/ra/h，简称旋毛虫)，可感染人 及150多种动物，它所引起的旋毛虫病是一种人畜共患寄生虫病，呈 全球性分布，严重地威胁了人类健康并对畜牧业造成巨大经济损失。 旋毛虫生活史简述如下当人或动物宿主生食或半生食含旋毛虫嚢包 的肉类(猪肉、狗肉等)，嚢包内幼虫在胃液、肠液作用下逸出并在 小肠内发育为成虫。雌、雄虫交配后雌虫产新生幼虫。新生幼虫侵入 肠粘膜淋巴管或静脉，随淋巴和血循环到达宿主横紋肌继续发育。旋 毛虫的致病过程分为三期侵入期、幼虫移行及囊包形成期，即在该 虫生活史的每个环节均可使宿主致病。
旋毛虫病临床表现复杂多样，诊断较困难，给及时的治疗造成一定 难度，因此该病的免疫诊断及预防成为当务之急。由于病原体不能在 体外大量传代培养，限制了抗原的获取；加之旋毛虫抗原的复杂性、 多样性，造成目前尚无理想的高敏感度、高特异性的抗原作为诊断候 逸抗原分子。
发明内容
本发明的目的在于寻找和克隆旋毛虫抗原新基因，对该基因的 基因重组蛋白进行免疫学功能的研究，为旋毛虫病的免疫诊断及免疫 预防、治疗提供新的候选抗原分子。本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包含从如下组核苷酸序列
中选择的核苷酸序列或者由该核苷酸序列组成
(A) 与SEQ ID NO: 1所示序列或SEQ ID NO: 1中开放阅读框至 少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%
同源的核苷酸序列；
(B) 与SEQ ID NO: 1所示序列或SEQ ID NO: 1中开放阅读框的 互补序列在中等严格杂交条件、优选高严格杂交条件下可发生杂交的 核苷酸序列；
(C) 与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1中开放阅读框编码相同序 列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序 列；
(D) 编码如下氨基酸序列的核普酸序列SEQ ID NO: 2所示序列， 或者，由于一或多个(例如1 - 25个、l-20个，l-15个，l-10个， 1 - 5个，1 - 3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO: 2所示序列有所不同的氨基酸序列；
(E) SEQ ID NO: 1所示序列或SEQ ID NO: 1中开放阅读框；
(F) (A)、 (B)、 (C) 、 (D)或(E)所述核普酸序列的片段；和
(G) 与(A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E)或(F)所述核苷酸序列互补的核 苷酸序列。
优选地，本发明的多核苷酸分子编码具有免疫原性的多肽。
SEQ ID NO: 1中开放阅读框是指SEQ ID NO: 1第208-1881位核
香酸所示的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，所述的多核苷酸分子具有SEQ ID NO: 1
所示核苷酸序列或者SEQ ID NO: 1第208-1881位核苷酸所示开放阅
读框序列。
本发明还涉及上述多核苷酸分子编码的多肽。 本发明还提供了分离的多肽，其包含从如下组氨基酸序列中选择 的氨基酸序列或者由该氨基酸序列组成
(A)与SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同源的氨基酸序列；
(B) 由于一或多个(例如1-25个、l-20个，l-15个，1-10 个，1 - 5个，1 - 3个))氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO: 2所示序列有所不同的氨基酸序列；
(C) SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列；和
(D) (A)或(B)或(C)所述氨基酸序列的免疫原性片段。
优选地，本发明的多肽具有免疫原性，特别是能够诱发有效抵抗 旋毛虫的免疫应答。在一个实施方案中，本发明多肽来自旋毛虫。 本发明还涉及编码该多肽的分离的多核普酸分子。 在一个具体实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
本发明的一个方面提供了一种多核苷酸分子，其中包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或者其高度同源序列。
在一个实施方案中，本发明不包括由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序 列或者SEQ ID NO: 1第208-1881位核苷酸所示开放阅读框序列组成 的多核苷酸分子，及由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列组成的多肽。
在一个实施方案中，本发明不包括由GenBank注册号AY046874 所示核普酸序列或者其第208-1881位核苷酸所示开放阅读框序列组 成的多核苷酸分子，及由AY046874所示核苷酸序列第208-1881位核 苷酸编码的氨基酸序列组成的多肽。
本发明还提供重组载体，其包含本发明所述多核苷酸分子。优选 所述重组栽体是表达载体，其包含并能够表达本发明所述多核苷酸分子。
本发明还提供含有本发明重组表达载体的宿主细胞，包括原核细 胞如大肠杆菌细胞和真核细胞，还包括微生物细胞、植物细胞、动物 细胞等，例如常规的克隆和表达用宿主细胞。
本发明还提供生产多肽的方法，包括在能使所述多肽表达的条件 下培养本发明所述的宿主细胞和回收所表达的多肽。本发明还提供抗体，其可特异性结合本发明所述多肽。所述抗体可以是多克隆或者单克隆抗体。
本发明还提供用于预防或治疗动物，尤其是牲畜和人的旋毛虫感染的药物组合物，所述的药物組合物中含有本发明所述多肽或者多核苷酸或者抗体或者载体或者宿主细胞。
本发明还提供用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的诊断试剂盒，其中含有本发明所述多核苷酸分子、可检测本发明所述多核苷酸分子的核酸探针、可特异性扩增本发明所述多核苷酸分子的引物、本发明所述多肽、或者本发明所述抗体。
本发明提供本发明所述多核苷酸分子、可检测本发明所述多核苷酸分子的核酸探针、可特异性扩增本发明所述多核苷酸分子的引物、本发明所述多肽、或者本发明所述抗体在制备用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的诊断试剂中的用途。
本发明还提供本发明所述多核苷酸分子或者多肽或者抗体或者载体或者宿主细胞在制备用于预防或治疗人畜旋毛虫感染的药物中的用途。
本发明还提供寡核苷酸，其含有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或SEQ ID NO: 1第208-1881位核苷酸所示开放阅读框序列或者其互补序列中的至少15个、优选至少25个、更优选至少50个核苷酸或者其相似序列，所述相似序列能够与SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或者其互补序列在高度严格杂交条件下发生杂交。优选地，所述寡核苷酸是可检测本发明所述多核苷酸分子的核酸探针、或者可特异性扩增本发明所述多核苷酸分子的引物。
本发明还提供本发明寡核苷酸用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的用途。
本发明还提供融合蛋白，其包含本发明所述多肽及另一融合对象(即另一氨基酸序列)。在一个具体实施方案中，所述另一融合对象是(3-半乳糖普酶，谷胱苷肽-S-转移酶或多组氨酸等。本发明还涉及编码该融合蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸分子可以用免疫筛选从旋毛虫cDNA基因文库中获得。本发明还涉及该序列的变异体，例如一个或多个碱基的缺失、添加或替换，但不改变所编码的蛋白质的功能。变异体可以是天然存在的等效变异体或非天然存在的变异体。
本发明的多肽可以通过构建上述基因的原核或真核表达载体，转化到适合的宿主细胞中，从培养物中纯化多肽来制备。本发明的多肽包括序列2的多肽，以及具有等效功能的它的衍生物、片段或类似物。
作为具体实例，本发明发明人利用分子生物学技术，如cDNA文库免疫筛选、分子克隆、聚合酶链式反应(PCR) 、 DNA序列测定、Southern杂交、Western印迹杂交法，克隆鉴定了旋毛虫抗原新基因70KDa热休克蛋白基因；利用基因表达及免疫学技术获得该基因的重组蛋白及高效价免疫血清；并对该蛋白免疫原性及免疫保护性进行了分析。
该基因达到的技术指标为
1. 在本发明中采用cDNA文库免疫篩选获得该基因的全长cDNA序列。全长2152bp，起始密码子ATG位于序列第208bp处，TGA为终止密码子，编码的蛋白质含557个氨基酸。
2. 旋毛虫70KDa热休克蛋白基因的557个氨基酸重组蛋白在大肠杆菌BL21林中获得表达并纯化(图1)。
3. 旋毛虫70KDa热休克蛋白基因重组蛋白免疫动物获高滴度抗70KDa热休克蛋白免疫血清。
4. 旋毛虫70KDa热休克蛋白基因重组蛋白为抗His抗体，感染旋毛虫的病人血清、兔血清、猪血清、小鼠血清所识别，并与70KDa热休克蛋白基因重组蛋白人工免疫小鼠血清发生反应(图2)。
5. 旋毛虫70KDa热休克蛋白基因重組蛋白免疫动物后对攻击感染产生有效的免疫保护性(表l)。
本发明发现了旋毛虫70KDa热休克蛋白抗原基因全长cDNA;获得了纯化的70KDa热休克蛋白基因重组蛋白及进行了免疫学功能的
9研究，为旋毛虫病的免疫预防提供了新的保护性候选抗原分子，并且也可以用于制备诊断试剂。
图1 SDS-PAGE电泳旋毛虫70KDa热休克蛋白基因重组蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化
1. 蛋白分子量标准
2. 未经IPTG诱导的全菌蛋白
3. IPTG诱导8小时的全菌蛋白
4. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重组蛋白箭头所指为重组蛋白带
图2 Western免疫印迹鉴定旋毛虫70KDa热休克蛋白基因重组蛋白的免疫特性
1. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重組蛋白与抗His抗体反应
2. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重组蛋白与旋毛虫病人血清反
应
3. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重组蛋白与感染旋毛虫的兔血清反应
4. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重組蛋白与感染旋毛虫的猪血清反应
5. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重组蛋白与感染旋毛虫的小鼠血清反应
6. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重组蛋白与该重组蛋白免疫小鼠血清反应
图3不同刺激物刺'M BMDC表面CD86表达情况同型抗体对照A.阴性对照组DC;C. LPS阳性对照组DC; E.r7^-Hsp70实验组DC; G.变性r7y"Hsp70组DC
CDllc+、 CD86+双阳性细胞百分数B.阴性对照组DC; D.LPS阳性对
10照组DC; F. iTs^Hsp70实验组DC; H.变性r 7^Hsp70组DC图4不同组细胞中CDllc+、 CD86+双阳性细胞数图5不同刺激物培养24小时的DC培养上清中IL-12P70水平注"与不加刺激物(control)组DC比较，P〈0.01;'与LPS刺激物
组DC和rrs-Hsp70刺激物組DC比较，P<0. 05
图6不同刺激物培养2 4小时的BMDC培养上清中TNF- oc水平
注'与不加刺激物(control)组BMDC比较，P<0. 05
图7扫描电镜下不同剌激物培养24小时的BMDC形态(放大倍数1500
x )。 A.阴性对照组DC; B. LPS阳性对照组DC; C. r7—Hsp70实验组DC;
D.变性r7^"Hsp70组DC。
图8透射电镜下不同刺激物培养1天的DC形态(5000 x )
A.阴性对照组DC; B. LPS阳性对照组DC; C. rr5"Hsp70实验组DC;
D.变性r7^Hsp70组DC
具体实施例方式
本文所用的术语"多核苷酸分子"、"多核苷酸序列"、"编码序列"、"开放阅读框(ORF)"等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册,冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前l支术，Greene PublishingAssociates & Wiley Interscience， NY; Sambrook等，1989， 分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995， PCR策略，Academic Press ， Inc., San Diego;和Erlich(编)，1992， PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。
本发明提供了包含编码旋毛虫70KDa热休克蛋白的核苷酸序列的一种分离多核苷酸分子。该多核苷酸分子可用于实施本发明。在进一步的优选实施方案中，本发明分离的多核苷酸分子包含选自下列成员
的核苷酸序列(1) SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列；(2)与SEQ IDNO: 1所示核苷酸序列至少70%相同、优选至少80%相同、更优选至少90%相同、最优选95%或98°/。相同的核苷酸序列；(3)在中等严谨杂交条件下(即在0. 5M NaHP04、 7°/。十二烷基石危酸钠(SDS) 、 lmM EDTA中于65匸与结合于滤膜的DNA杂交，并在0, 2xSSC/0. 1%SDS中于42。C洗涤的条件；参见Ausubel等(编)，1989，分子生物学当前技术，第1巻，Green Publishing Associntes， Inc. ， and John Wiley & Sons,Inc., NY, P. 2.10.3)、优选高度严谨杂交条件(即在0. 5M NaHP04、7%SDS、 lmM EDTA中于65匸与结合于滤膜的DNA杂交，并在0. lxSSC/0. 1% SDS中于68X:洗涤条件；参阅Ausubel等，1989，上述文献)下与具有SEQ ID NO: 1或其互补序列的多核苷酸分子能杂交的核苷酸序列；(4)与SEQ ID NO: l编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列；或者(5)与(l)-(4)
中任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明多核苷酸分子包含编码旋毛虫70KDa
热休克蛋白的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明多核苷酸分子可用于以标准扩增技术扩增旋毛虫特异性多核苷酸分子，或作为诊断试剂用以检测被旋毛虫感染的动物体液或组织样品中旋毛虫特异性多核苷酸的存在。
本发明进一步提供包含编码同源于旋毛虫70KDa热休克蛋白或免疫原性多肽之多肽的核苷酸序列的一种分离多核苷酸分子。本文中提到同源于旋毛虫70KDa热休克蛋白或免疫原性多肽的多肽时所使用的术语"同源，，是指多肽本来具有旋毛虫70KDa热休克蛋白或免疫原性多肽的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守地取代(例如1-25个、l-20个，1-15个，1-10个，1-5个)，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸取代是本领域已知的。造成这样的取代的规则包含由Dayhof， M. D. (1978，国家生物医学研究基金，Washington, D. C.，第5巻，增刊3)等所述的取代规则。更具体地说，保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或 侧链大小相关联的氨基酸家族内。 一般可将遗传编码的氨基酸分为四
组(l)酸性氨基酸-天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸=赖氨酸、 精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电的极性氨基 酸-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分类为芳香氨基酸。任何特 定组内的一个或多个取代，例如用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、或 用谷氨酸取代天冬氨酸、或用丝氨酸取代苏氨酸，或任何其他氨基酸 残基结构上相关的氨基酸残基，例如有相似酸性、极性、侧链大小的， 或在其某些组合方面有相似性的氨基酸残基取代， 一般对多肽的功能
或免疫原性不会有太大影响。
基本同源的蛋白质和多肽其特征在于具有一个或多个氨基酸取代
(仓寸:i口l一25个、l一20个，1一15个，1一10个，l一5个)、册J除或 添加。这些改变优选影响较小的变换，即保守氨基酸取代(见表2)及 其它不会严重影响蛋白质或多肽的折叠和活性的取代；小的删除，通 常是1-约30个氨基酸的小删除；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如 氨基末端甲硫氨酸残基，长达约20-25个残基的小连接肽，或便于纯 化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸束、蛋白A (Nilsson等，EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson等，酶学方法，198: 3， 1991)。编码亲和标记 的DNA可从产品供应商处购买到。
本文中所说的多肽"可用于实施本发明，，是指该多肽可用作诊断试 剂，以检测新近被旋毛虫感染的、或已被旋毛虫感染的动物血液或血 清样品中旋毛虫特异性抗体的存在；或者可用作抗原产生旋毛虫特异 性抗体(例如特异结合的抗体、中和性抗体、治疗性抗体)；或者可
作为免疫原对动物进行预防性免疫或者治疗性免疫，或者本文提到的 该多肽的任何用途。
本发明进一步提供与本发明上述多核苷酸分子能杂交，或与具有作 ^胡卜W容核吝酸A-
13杂交的多核苷酸分子。这样的寡核苷酸分子较好是至少长约15nt，更 好是长约25 nt，尤其是至少50nt，并可在高度严紧条件下与一种或 多种上述多核苷酸分子杂交。所说的高度严紧条件是在6XSSC/0. 5%焦 磷酸钠中洗膜，并且洗膜温度对于长约14碱基者为大约37X:，长约 17碱基者为大约48X:，长约20碱基者为大约55C，长约23碱基者 为大约60X:。本发明的较长寡核苷酸分子的其他杂交条件可由本领域 技术人员按照标准技术来确定。在一优选实施方案中，本发明的寡核 苷酸分子互补于本发明上述多核苷酸分子至少之一的一部分。
本发明的寡核苷酸分子可用于多种目的，其中包括作为扩增旋毛 虫特异性多核苷酸分子的引物以用于诸如疾病鉴别诊断，或者编码或 用作基因调节的反义分子。就诊断方面来说，可使用适当设计的引物 检测动物组织或体液等样品中旋毛虫特异性多核苷酸分子的存在。特 异性扩增产物的产生可支持旋毛虫感染的诊断，而缺少扩增的产物则 可能指示没有感染。例如Innis等人(1995 ，出处同前)和 Erlicch(1992,出处同前)编辑的前述文献中描述了进行扩增的方法， 例如聚合酶链反应(PCR)方法。本领域已知的其他扩增技术也可使用， 例如连接酶链反应法。也可使用本文公开的多核苷酸分子的序列设计 用于从旋毛虫的其他种或林系中分离同源基因的引物。
本发明进一步提供包含本发明多核苷酸分子的克隆载体、表达栽 体、包含任何所说载体的被转化宿主细胞，以及由其衍生的新的林系 或细胞系。在一优选实施方案中，本发明提供包含一种多核苷酸分子 的重组栽体，所说多核苷酸分子具有编码旋毛虫70KDa热休克蛋白或 免疫原性多肽的核苷酸序列。
优选地，本发明的重组载体，特别是表达载体的构建方式能使得 本发明多核苷酸分子的编码序列与转录和翻译编码序列所需的一个或 多个调节元件可操作性地连接，以产生多肽。本文中使用的术语"调 节元件，，包括但不只限于编码诱导型和非诱导型启动子、增强子、操
其它元件的核苷酸序列。另外，本文所说的编码序列与一个或多个调节元件"可操作性地连接"是指调节元件可有效地调节并允许转录编
码序列或翻译其mRNA,或发挥两方面的功能。
构建包含与适当的调节元件可操作性地连接的特定编码序列的重 组载体的方法是已知的，并可使用这些方法实现本发明。这些方法包 括体外重组技术、合成技术和体内遗传重组(如参见Maniatis等人 (1989)的上述文献)。
可用于表达本发明的旋毛虫70KDa热休克蛋白编码序列的各种栽 体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA、 质粒DNA和粘粒DNA表达载体。可经加工而含有本发明的多核苷酸分 子的质粒包括pUC8、 pUC9、 pBR322和pBR329 (Biorad Laboratories, Richmond, CA) 、 pPL和pKK223 (Pharmacia， Piscataway, NJ)、 pQE50 (Qiagen， Chatsworth， CA)和pGEM -TEASY (Promega， Madison, WI)等。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型真核表达载体包 括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统(Invitrogen， Carlsbad， CA )、 基于巨细胞病毒启动子-增强子的系统(Promega， Madison， WI; Stratagene, La Jolla， CA; Invitrogen)，和基于杆状病毒的表达 系统(Promega )等。
这些和其他载体的调节元件可在其强度和特异性方面各不相同。 基于所利用的宿主/载体系统，可以使用多种适当的转录和翻译元件 中的任一种。例如，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用从哺乳 动物细胞基因组中分离的启动子，如小鼠金属疏蛋白启动子，或从生 长于这些细胞内的病毒中分离的启动子，如痘苗病毒7. 5K启动子或莫 洛尼鼠类肉瘤病毒长末端重复序列。可使用以重组DNA或合成技术得 到的启动子以转录被插入的序列。另外，在特定诱导子，例如适于金 属硫蛋白启动子的锌和镉离子的存在下，由某些启动子启动的表达可 以被增强。转录调节区或启动子的非限制性例子包括用于细菌的P -gal启动子、T7启动子、TAC启动子、trp和lac启动子、trp- lac 融合启动子等；用于酵母的糖酵解酶启动子，如ADH-和ADH- II启动 子、GPK启动子、PGI启动子、TRP启动子等；以及用于哺乳动物细胞的SV40早期和晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子等。本发明进一步 提供包含旋毛虫70KDa热休克蛋白基因之启动子的核苷酸序列的多核 苷酸分子，其可用于在旋毛虫中表达本发明的编码序列。
为足够地翻译被插入的编码序列，还需要特异性起始信号。这些 信号一般包括ATG起始密码子及相邻序列。在将包含其自身的起始密
情况下，可能不必加入另外的翻译控制信号。然而，当只插入一部分 编码序列时，可能需要包括ATG起始密码子等的外源翻译控制信号。 可从各种来源，即天然和合成来源，得到这些外源翻译控制信号和起 始密码子。再者，起始密码子必须与编码区的读框一致，以确保整个 插入片段符合读框地翻译。
也可构建将表达包含本发明蛋白质或多肽和融合对象的融合蛋白 质的表达载体。这样的融合蛋白质例如可用于产生抗旋毛虫蛋白的抗 血清、研究旋毛虫蛋白的生化性质、工程化修饰表现有不同免疫学或 功能性质的旋毛虫蛋白、帮助鉴定或纯化重组表达的旋毛虫蛋白或改 善其稳定性。可能的融合蛋白表达载体包括但不只限于插入了编码P 半乳糖苷酶和trpE融合体、麦芽糖结合蛋白融合体、谷胱甘肽-S-转移酶融合体及多组氨酸融合体(载体区域)之序列的载体。可用于 构建编码这些和其他融合蛋白的表达载体的方法是本领域已知的。
可用融合蛋白质帮助纯化已表达的蛋白质。在一非限制性实施方 案中，可使用直链淀粉树脂纯化热休克蛋白70-麦芽糖结合性融合蛋 白，可使用谷胱甘肽琼脂糖小球纯化热休克蛋白7G-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质，可使用二价镍树脂纯化热休克蛋白70-多组氨酸 融合蛋白质。或者，也可使用抗载体蛋白质或肽的抗体对融合蛋白质 进行亲和层析纯化。例如，可将编码单克隆抗体之靶表位的核苷酸序 列工程化转移到与调节元件可操作性地连接的表达载体中，并限定其 位置以使所表达的表位融合到本发明的旋毛虫蛋白上。在一非限制性 实施方案中，可用标准技术在相当于热休克蛋白70蛋白之氨基或羧基 末端的某个点上插入编码FLAG 表位标记(其为亲水性标记狀)(Znternational Biotechnologies Inc.)的核苦酸序歹'J中，然后 可使用市售的抗FLAGTM抗体检测并亲和纯化所表达的热休克蛋白70 -FLAGTM表位融合体产物。
也可以修饰表达载体使之含有编码特定蛋白酶切割位点的多接头 序列，从而可经特定蛋白酶处理而从载体区域或融合对象释放出已表 达的旋毛虫蛋白。例如，融合蛋白栽体可包含编码凝血酶或因子Xa裂 解位点的核苷酸序列。
可使用已知方法将位于旋毛虫蛋白编码序列上游且读框一致的信 号序列加工到表达载体中，以指导所表达之蛋白质的运输和分泌。信 号序列的非限制性实例包括ot因子、免疫球蛋白、外膜蛋白质、青霉 素酶及T细胞受体等的信号序列。
为了有助于筛选出经本发明重组载体转化或转染的宿主细胞，可 以工程化修饰载体使之进一 步包含报道基因产物或其他选择标志的编 码序列。这样的编码序列较好是与上述调节元件可操作性地连接的。 用于实施本发明的报道基因是本领域熟知的，包括编码氯霉素乙酰转 移酶(CAT)、绿色荧光蛋白、荧火虫荧光素酶和人生长激素等的基因。 编码选择标志的核苷酸序列是本领域已知的，包括编码赋予抗生素抗 性或抗代谢物抗性，或提供营养缺陷型需要等的基因产物的那些核苷 酸序列。这些序列的例子包括编码胸苷激酶活性，或抗氨甲喋呤、氨 苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、氨基糖苷或潮霉素等的那些序列。
本发明进一步提供包含本发明的多核苷酸分子或重组载体的已转 化宿主细胞，以及由之衍生的细胞系。可用于实施本发明的宿主细胞 可以是真核或原核细胞。这样的已转化宿主细胞包括但不只限于微生 物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，
或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如 杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感 染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌林，如DH5a菌林。真 核宿主细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或 人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH/3T3等。
较好是将本发明的重组载体转化或转染到细胞的基本均一培养物 的一个或多个宿主细胞中。 一般可按照已知技术，例如原生质体转化、 磷酸钓沉淀、氯化钾处理、微量注射、电穿孔、经与重组的病毒接触 进行感染、脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖转染、转导、接合或微 粒轰击等技术将载体导入宿主细胞内。可使用标准方法选择转化体， 例如通过选择表达与重组表达载体相关的可选择标志如抗生素抗性的 细胞的方法。
一旦将表达载体导入宿主细胞后，即可使用Southern杂交分析、 限制性酶切分析、包括反转录酶PCR (rt - PCR)的PCR分析等标准技术
证实本发明的多核苷酸分子是否整合并保留在宿主细胞基因组中或以 附加体形式存在，或者用免疫学检测法检测预期的蛋白质产物。可用 本领域已知的至少下列四种一般性方法中的一种鉴定含有和/或表达 本发明的多核苷酸分子的宿主细胞(i)DNA-DNA、 DNA-RNA、或RNA -反义RNA杂交；(ii)检测"标志"基因功能的存在；(iii)检测特异 性mRNA转录本在宿主细胞中的表达，以估计转录水平；或(iv)以本领 域已知的免疫检测法检测成熟多肽产物的存在。
一旦已将本发明的多核苷酸分子稳定导入到适当的宿主细胞中之 后，即可克隆增殖已转化的宿主细胞，并在有助于最大量产生所编码 的多肽的条件下培养所得到的细胞。这样的条件一般包括培养已转化 的细胞达到高密度。当表达载体含有诱导型启动子时，可根据需要， 利用温度改变、营养素耗尽、加入义务诱导剂(如糖类类似物，例如异 丙基p - D -硫代半乳糖苷(IPTG)、过量代谢付产物积聚等适当诱导条 件以诱导表达。
当多肽保留在宿主细胞内时，应收获并裂解细胞，并在本领域已 知的尽可能减少蛋白质降解的提取条件下，例如于4。C和/或有蛋白酶 抑制剂存在条件下，从裂解物中基本上纯化或分离产物。如多肽能从
宿主细胞中分泌出来，则可简单地收集已耗竭的营养素培养基，并从 中基本上纯化或分离多肽。
18必要时，可使用标准方法，包括但不只限于硫酸铵沉淀，大小分
级分离、离子交换层析、HPLC、密度梯度离心及亲和层析法，从细胞 裂解物或培养基中基本上纯化或分离多肽。如果多肽缺乏生物学活性， 则可作根据分子大小、或与多肽特异性抗体的反应性，或根据融合体
标记的存在检测之。用于实施本发明时，多肽可以是已分泌到培养液 中或存在于细胞裂解物中的未纯化状态，但较好是已从中得到基本纯 化或分离。本文中所说的多肽"基本上已纯化"，是指该多肽构成特
定制剂中蛋白质的至少约2oy。(重量)。另外，本文中所说的多肽"已
分离"，指的是该多肽构成特定制剂中蛋白质的至少约80%(重量)。
因此，本发明提供由本发明多核苷酸编码的基本上已纯化或分离 的旋毛虫70KDa热休克蛋白。在一优选实施方案中，旋毛虫70KDa热 休克蛋白具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
本发明进一步提供同源于所述旋毛虫70KDa热休克蛋白的多肽， 其中术语"同源，，具有上文就多肽所限定的含义。
本发明进一步提供由本发明任何一种上述多肽的基本部分組成的 多肽。本文使用的术语-本发明多肽的"基本部分"或"肽片段"意 指组成上小于相应全长度多肽之完整氨基酸序列、但包含其氨基酸序 列的至少约10%、较好至少约20%、并可用于实施本发明的多肽("可 用于"具有上文就多肽所限定的含义)。特别优选的是具有免疫原性 (即能够诱导免疫反应而产生特异地抗相应的全长度旋毛虫多肽的抗 体)的肽片段。
本发明进一步提供包含与本领域已知的载体或融合对象融合的任 一种上述多肽的融合蛋白质。
本发明的多肽可用于多种目的，包括作为诊断试剂，例如以ELISA 检测等标准检测法筛选动物血液或血清样品中的旋毛虫特异性抗体； 或如下所述用作产生多克隆或单克隆抗体的抗原，其中可以使用所述 抗体作为诊断试剂，例如以Western印迹检测法等标准技术筛选动物 细胞、组织或体液样品中的旋毛虫特异性蛋白质。
可以在蛋白质水平上修饰本发明的任何多肽，以改善或改变其生
19物学或免疫学特征。可使用已知技术对多肽进行一种或多种化学修饰， 以制备其类似物。
可以在分子上连接一个或多个化学基团或另一种蛋白质如血清白
蛋白、匙孔虫戚血兰蛋白或BSA,或者多聚氨基酸(如多聚赖氨酸)，或 多糖(如Sepharose，琼脂糖，或经过修饰或未经#"饰的纤维素)上等， 以制备本发明多肽的衍生物。进行这些连接反应的方法是蛋白质化学 领域中已知的。
本发明进一步提供抗本发明多肽的分离抗体。在一优选实施方案 中，可使用已知方法产生抗旋毛虫70KDa热休克蛋白的抗体。可用部 分或基本上纯化或分离的旋毛虫70KDa热休克蛋白重组蛋白，或其如 上文描述的同系物、融合蛋白、基本部分、类似物或衍生物免疫选自 猪、牛、马、兔、山羊、绵羊或小鼠等各种宿主动物。可使用下文描 述的佐剂提高抗体产生量。
可从被免疫动物的血清中得到和分离多克隆抗体，并使用常规方 法试验其对抗原的特异性。或者，也可使用由培养的连续细胞系生产 抗体分子的任何技术制备并分离单克隆抗体。这些技术包括但不只限 于原先由Kohler和Milstein(自然，1975， 256 : 495 - 497)描述的杂 交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983,今日免疫学，4:72; Cote等，1983，美国国家科学院院报，80: 2026 - 2030)，以及EBV 杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R. Liss, Inc., pp. 77 - 86)。或者，可釆用已述的生产单链抗体的技术(如参 见美国专利4， 946， 778)生产旋毛虫抗原特异性单链抗体。
含有本发明多肽的特异性结合位点的抗体片段也包括在本发明范 围内，并可用已知技术制备。这样的片段包括但不只限于可由胃蛋白 酶消化完整抗体分子而产生的F(ab')2片段，和可经还原F(ab')2片段 的二硫桥而产生的Fab片段。或者，也可构建Fab表达文库(Huse等， 1989,科学，246: 1275 - 1281 ),以迅速鉴定对旋毛虫蛋白有所需特 异性的Fab片段。
生产和分离单克隆抗体及抗体片段的技术是本领域已知的，并在例如下列文献中给出了更详细的描述Harlow和Lane, 1988，抗体 实验室手册,冷泉港实验室和J.W. Cooding， 1986，单克隆抗体原 理与实践，Academic Press, London (其歹'J为本文参考文献)。 下列实施例只是举例描述，而不用来限制本发明的范围。
实施例
实施例1 旋毛虫70KDa热休克蛋白基因的克隆及序列分析
1. 筛选血清(人工免疫兔血清)的制备
收集分离自猪体的黑龙江林旋毛虫(国际标准虫株编码ISS533 ) 成虫，将成虫虫体放于研磨器中，冰浴下快速研磨15分钟。将研磨 后的液体移入10ml离心管，超声(于水上)3次，3分钟/次，中间 休息1分钟。反复冻融数次，离心取上清即得全虫可溶性抗原。免疫 曰本大耳白兔(1. 6mg/只)，每周加强1次，加强4次，获得人工免 疫兔血清。经ELISA测定，人工免疫兔血清滴度达1 : 4000以上。
2. 免疫筛选表达文库
旋毛虫成虫入ZAPIIcDNA表达文库购自刘明远(参考文献《中国 旋毛虫分离林成虫和新生幼虫基因文库的构建和筛选》，中国兽医学 报，1998， 18 ( 2 ) : 147-150.)。
1 p 1旋毛虫成虫入ZAP II cDNA表达文库稀释液加入600 y 1宿主 菌XL1-Blue中，37°C,吸附20分钟加入顶层琼脂，倒置于42T温 箱中培养至有针尖大小的噬菌斑长出。把硝酸纤维素膜(Gelman公 司)铺在平板上，放在37t:温箱培养过夜。第二天在室温下将膜做 好标记，从平板上揭下，浸入一抗工作液(人工免疫兔血清用TBST 以1: 1000稀释)30分钟，血清中加入了大肠杆菌噬菌体裂解液
(STRTAGENE公司)。把膜浸入二抗工作液一l: 7500碱性磷酸酶-羊抗兔IgG (Promega公司)，30分钟。浸入显色液NBT、 BCIP中
(Promega公司)，显色充分后，加入ddH20终止。用1: 1000人工 免疫兔血清筛选文库共获得9个阳性克隆，经PCR及Southern Blot鉴定后，选取4号克隆进行DNA序列测定。 3. 4号克隆核苷酸序列与编码的氨基酸分析
4号克隆核苷酸序列全长2152bp(见SEQ ID NO: 1)，开放阅读框 (第208-1881位，共1674bp )，编码557个氨基酸(见SEQ ID NO: 2)，其理论分子量为64. 05KDa。同源性分析结果显示4号克隆编 码的蛋白质与秀丽隐杆线虫、班氏丝虫、日本血吸虫、刚地弓形虫、 恶性痦原虫的70KDa热休克蛋白分别具有82%, 73%, 70%, 67%和61% 的同源性。我们推断4号克隆是一个旋毛虫70KDa热休克蛋白基因。
实施例2 制备70KDa热休克蛋白基因重组蛋白及人工免疫小鼠血清
1. 70KDa热休克蛋白基因原核表达及纯化
根据4号克隆核苷酸序列，设计一对引物，上游引物为5 '-CGCAGGATCCATGGTCGGTCGAGAATG -3，(共27bp，含一个BamH I酶 切位点)，下游引物为5 '-GATACTCGAGACAGTTCATCTTTTTCTTCA -3' (共30bp，含一个Xho I酶切位点)。以免疫筛库得到的4号克隆为 模板，进行PCR,产物经BamH I和Xho I双酶切后，亚克隆于原核表 达载体pET-28a ( + ) (NovageiW^司)。正确的重組质粒转化大肠杆 菌BL21林(Novagen公司)，经37。C、 150转/分、1. OmM IPTG诱 导8小时，获得70KDa热休克蛋白基因重组蛋白(全部开放阅读框共 编码557个氨基酸)，重组蛋白经His-Mnding亲和层析柱(Novagen 公司)纯化后获得较高纯度(图1)。
2. 纯化的70KDa热休克蛋白基因重组蛋白经皮肤多点注射免疫 BALB/c小鼠(20yg/只)，以后每隔14天以相同剂量抗原加等量不 完全弗氏佐剂，加强2次。5周后摘眼球取血。ELISA测定抗体效价 高达l: 128000以上。
实施例3 70KDa热休克蛋白基因重组蛋白的免疫特性 1.酶联免疫吸附(ELISA)检测以lUg 70KDa热休克蛋白基因重组蛋白(实施例2制备)为抗 原包被96孔酶标板， 一抗为抗His抗体和待检血清，二抗为辣根过 氧化物酶标记的相应(羊抗人、羊抗兔、羊抗猪或羊抗小鼠)二抗， 正常人血清、正常兔血清、正常猪血清、正常小鼠血清分别作为阴性 对照。根据待测血清样本OD值大于阴性对照2. 1倍者为阳性判断结 果。经ELISA检测，旋毛虫病人血清(8份)阳性率为90%、旋毛虫 病兔血清(2份)、旋毛虫病猪血清(3份)及旋毛虫感染的小鼠血 清(2份)均为阳性，说明该70KDa热休克蛋白基因的重组蛋白具有 特异的抗原性，是具有应用潜力的诊断试剂。 2. Western印迹分析
纯化的70KDa热休克蛋白基因表达蛋白(实施例2制备)(200ng ) 经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，用ECL化学发光试剂盒 (Amersham公司)检测，分别以病人血清l: 100、感染兔血清1: 100、感染猪血清1: 1000、感染小鼠血清l: 100、 70KDa热休克蛋 白基因重组蛋白人工免疫小鼠血清(实施例2制备)1: 20000作为 第一抗体。结果显示约70KDa处均呈现一明显的蛋白印迹带(图2)， 表明70KDa热休克蛋白基因重组蛋白可为抗His抗体、感染旋毛虫的 病人血清、感染旋毛虫的兔血清、感染旋毛虫的猪血清、感染旋毛虫 的小鼠血清及70KDa热休克蛋白基因重組蛋白人工免疫小鼠血清所 识别。
实施例4 动物体内保护性实验
BALB/c小鼠20只，随机分为2组，每组10只。70KDa热休克蛋 白基因重组蛋白免疫组以20pg/只的抗原(实施例2制备)加等量 的弗氏完全佐剂(FCA)皮下注射。以后每隔14天以相同剂量抗原加 等量不完全弗氏佐剂，加强2次。末次注射后10天，每只鼠用400 条旋毛虫感染性幼虫进行攻击感染。对照组注射相同剂量的PBS，与 免疫组同时接受400条旋毛虫感染性幼虫攻击。于攻击46天后将小鼠处死，取全部肌肉用胃蛋白酶消化收集幼虫，计数。经单因素方差
分析，70KDa热休克蛋白基因重组蛋白免疫组减虫率(肌幼虫减虫率 %=对照组肌幼虫数-免疫组肌幼虫数)/对照组肌幼虫数x 100%)为 37%，与对照组比较，有显著性差异(P<0. 01)(表l)。
由于本实验70KDa热休克蛋白基因重组蛋白在动物体内产生有 效的减虫率，据此可作为保护性候选抗原，应用于旋毛虫病的免疫预 防。
表1 70KDa热休克蛋白基因重组蛋白免疫BALB/c小鼠的保护性 结果
组别BALB/c平均肌幼虫数肌幼虫减虫率P值
的数目又土SD%
免疫组104440±278. 21737<0. 01
对照组107072±410. 433一
实施例5 旋毛虫70KDa热休克蛋白基因重组蛋白(r7^-Hsp70)对体 外培养的小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)的促成熟作用实验 1.小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)的分离和培养
取4-6周龄雌性BABL/c小鼠，断颈处死，95°/。酒精消毒。无菌条件 下分离并培养小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)。将加入完全培养基进行细 胞培养的这一天定义为BMDC培养的第1天。然后每隔1天(即BMDC培 养第2天、第4天、第6天，以此类推)对培养细胞进行半量换液小心 将每孔内液体弃去lral，再补入37X:预温的RPMI1640完全培养基lml， 使培养体系中各成分维持原有浓度不变，然后置于培养箱中继续培养。 当细胞培养至第6天时，分组加入不同的刺激物，即6pg/mlr7^-Hsp70
24(旋毛虫7OKDa热休克蛋白基因重组蛋白按照实施例2所述进行表达 及纯化)、ljig/mlLPS(细菌脂多糖，Sigma公司，货号L6529 )和6pg/ml 煮沸变性的r7—Hsp70，另外不加刺激物的BMDC为对照组。分别于细胞 培养的第7天，通过反复吹吸收集疏松粘附细胞及悬浮细胞用于下一步实验。
2.小鼠BMDC表面标志分子的流式细胞仪检测
上述加入刺激物的BMDC，继续培养24小时后，用RPMI1640液 (Hyclone公司，货号SH30809. 01B )反复吹吸，收集疏松粘附和悬浮 生长的细胞至50ml离心管中，1200rpm离心10min。弃上清，用DPBS 将细胞漂洗2次，1000rpm离心10min。弃上清，定容至l或2ml，将细 胞沉淀混匀后计数，调整细胞浓度，将细胞分装转入1. 5mlEppendorf 管，使每管细胞数量为lxl()6个。每份标本分装2管，即待检管和对照 管。1000rpm离心10min。弃上清，向待检管细胞沉淀中加入100ul已 用DPBS稀释好的PE标记的仓鼠抗小鼠CDllc单克隆抗体(BD Pharmingen公司，货号553802 )和FITC标记的大鼠抗小鼠CD86单克 隆抗体(BD Pharmingen公司，货号553691 )，同时另取对照管细胞 沉淀加入单抗的同型对照(即PE标记的仓鼠抗小鼠IgG和FITC标记的 大鼠抗小鼠IgG (BDPharmingen公司，货号分别是553954; 553929 ) lOOul,单抗和其同型对照的应用浓度均为0. 25ug/100ul体系。以上各 管混勻后4。C避光静置30min。各管细胞再用DPBS漂洗2遍后将细胞悬 浮于0. 5mlDPBS液中。通过流式细胞仪检测细胞表面CDllc分子及CD86 的表达情况。结果显示不加刺激物組DC， LPS刺激24小时培养组DC， rrs-Hsp70刺激24小时培养组DC以及变性r7》-Hsp70刺激24小时培养 组DC的同型抗体对照，发生非特异结合的细胞数都很少。不加刺激物 组DC: CDllc+、 CD86+双阳性细胞占培养细胞总数的15.0%; LPS刺激 24小时培养组DC: CDllc+、 CD86+双阳性细胞占培养细胞总数的28. 6%; rrs-Hsp70刺激24小时培养组DC: CDllc+、 CD86+双阳性细胞占培养细 胞总数的27%;变性rrs-Hsp70刺激24小时培养组DC: CDllc+、 CD86+双阳性细胞占培养细胞总数的18. 7%(图3和图4)。
3. ELISA测定小鼠BMDC培养上清中细胞因子含量的测定
为了检测不同组BMDC培养上清中IL-12P70和TNF-oc细胞因子含 量，我们采用了 IL-12P70 ELISA SET (BD Pharmingen/>司，货号 555256 )和TNF-cc ELISA SET ( BD Pharmingen公司，货号555268 ) 进行了双夹心ELISA实验，方法如下 3. 1标准品的准备
取小鼠细胞因子IL-12P70和TNFa标准品各一瓶，加lml无菌水， 充分混匀溶解，放置至少15min，分装后;^-80X:备用。取7个1. 5ml 管顺序标记最高浓度标准品、l:2稀释、l:4稀释、1: 8稀释、1:16 稀释、l:32稀释、l:64稀释；在最高浓度的标准品管内加入稀释液， 使其与标准品最终总体积为500jal;在其余管内分别加入300|il稀释液； 倍比稀释取原倍标准品300pl，加入到1:2稀释管中，充分混匀；取 1:2稀幹液300ili1,加入到1:4稀释管中，充分混匀，依此类推，稀释 液作为O对照。 3.2实验步骤
包被每孔加入100 p 1用包被液稀释的捕获抗体(抗小鼠各细胞因 子单克隆抗体(1: 250) ， 4"C包被过夜；弃去孔中液体，PBST洗涤3次； 每孔加入200 u 1封闭液，25C孵育lh;弃去孔中液体，PBST洗涤3次；
每孔加入100 ja 1脾细胞培养上清(1: 1稀释)以及梯度稀释的标准 品，25TC孵育2h;每个样本设1个复孔；弃去孔中液体，PBST洗涤3 次；每孔加100 n 1用封闭液稀释的检测抗体(生物素化的抗小鼠各细胞 因子单克隆抗体和链霉素-HRP亲和素混合物，25"C孵育lh;弃去孔中 液体，PBST洗5次，每次至少持续30秒；每孔加入100 p 1 TMB显色液， 室温避光反应30min;每孔加50ial 2M 112304终止反应。酶标4义450 nm 读数，与阴性对照比较0D值〉2. 1即判断为测定样品的OD值。结果显 示LPS组BMDC的细胞因子IL-12P70含量较不加刺激物组BMDC明显升 高，具有统计学意义(P〈0. 01);较煮沸变性的r7^Hsp70刺激组BMDC有所升高，具有统计学意义(P〈0. 05)。 LPS组的细胞因子TNF-ot含量 较不加刺激物组BMDC有所升高，具有统计学意义(P〈0. 05);较煮沸变 性的r7—Hsp70刺激组BMDC有所升高，具有统计学意义(P< 0. 05)。 r7，5"Hsp70组的细胞因子IL-12P70及TNF-oc含量较不加刺激物组有所 升高，具有统计学意义(P值分别为P<0. 01和P〈0. 05); r7》-Hsp70 刺激组BMDC的细胞因子IL-12P70的含量较煮沸变性的r7^Hsp70刺激 组BMDC有所升高，具有统计学意义(P〈0. 05); r7>-Hsp70组的细胞因 子IL-12P70及TNF-oc含量与LPS组比较无统计学差异(图5和图6)。 4. BMDC的形态观察
分别用扫描电镜和透射电镜观察同一方法培养的各组BMDC细胞的 形态。扫描电镜下可以清晰地看到各组培养DC的表面形态。未加任何 刺激物而继续培养1天的BMDC，表型上看胞体体积较大，细胞表面粗糙、 凹凸不平并有大量微小片状的突起，细胞表面呈现密集的绒毛状；LPS 刺激培养24小时的BMDC呈现出典型的成熟DC形态，即胞体变小，向 周围伸出浓密的大量树枝状突起，很多突起有分叉出现，并且细胞之间 的突起有的已形成连接；r7^Hsp70刺激培养24小时的BMDC也呈现出 成熟DC的典型形态；变性r7—Hsp70刺激培养24小时BMDC细胞突起 则相对少些，说明r7>-Hsp70煮沸10min后已部分变性，影响了其对DC 的刺激作用(图7 )。透射电镜下可以更清晰地看到各组培养BMDC的内 部典型形态，比如细胞核、线粒体等细胞器，而且成熟DC的树枝状突 起更为清晰，并且相邻的成熟DC之间的突起已经形成了连接(图8)。
以上实验结果提示r7—Hsp70刺激了体外培养的小鼠BMDC分化成 熟。r7^Hsp70可能通过诱导BMDC的成熟，从而激活了小鼠产生抗击旋 毛虫感染的免疫保护作用，其可以作为抗旋毛虫感染的疫苗候选分子。
上文列出的所有专利、专利申请和出版物均全文引入本文作为参 考文献。
本发明的范围不只限于所述的特定实施方案，这些方案只是作为
27本发明个别方面的单一举例说明给出的。功能等同的组合物和方法均 在本发明的范围之内。确实，除了本文所示的和描述的内容外，对本
见的。这些改动将落入本发明待批权利要求的范围之内。
核苷酸序列(SEQ ID N0: 1)(加下划线的碱基说明开放阅读框(SEQ ID NO: 1第208-1881位)的起始密码子、终止密码子位置)TTTTTTGAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
开放阅读框内的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2):
TNGDTHLGGEDFDQRVMEYFMKLYKKKTGKDIRKDNRAVQKLRREVEKGKRVLSTQHQTKIEIESFFDGEDFSE
KQQKKELEDIVQPIIGKLYKNAGEGAPPPPPDAEEKDEL序列表
<110> 首都医科大学
<120> 旋毛虫70KDa热休克蛋白及其应用
<130> IDC080057
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<211> 2152
<212> 駆
<213> 旋毛形线虫(Trichinella spiralis)
<400> 1
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<210> 2 <211> 557 <212> PRT
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Met Val Gly 1
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Uu Thr Val 35
Ala Met Val 50
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Leu Asp Lys 115
Gly Gly Thr
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Asp Gin Arg
Phe 20 Ser
Leu
Lys
Gin
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Ala 85 lie
lie 100
Lys Glu
Phe Ser
Val
Asp Thr
Val
Glu
Lys
Ala 70 Thr
Asn
Gly
Val
Val
Lys
Met 55 Val
Lys
Glu
Glu
Thr
Glu
Lys 40 Lys
Val
Asp
Pro
Gin Ala Asp Arg Lys 10 15
Lys Ser Ser Lys Pro Asn Val Gin
25 30
Leu Phe Thr Pro Glu Glu lie Ser 45
lie Ala Glu Ala Tyr
Glu Thr Ala
Lys
120 Leu Eeu 135
Gly Asp Thr
Thr
105 Asn lie
Val Pro 75
Gly Thr lie
90 Ala Ala
60 Ala Tyr
Asn 150
Glu Tyr Phe Met
Thr His Lys
Leu lie
Ala Val
Ala lie Tyr
Phe Gly Ala
Leu Gly Asn Asp
80
Leu Asn 95
Tyr Gly 110
Asp Leu Gly
I>eu
155 Leu Ty
Asp
140 Gly Gly
125 Asn Gly
Glu Met Asp
Asp
235 Ala Gly 250 Gly Ser Thr
Met
165 170 Gly Lys Asp lie Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gin 180 185 Lys Gly Lys Arg Val Uu Ser Thr Gin 200
Glu Ser Phe Phe Asp Gly Glu Asp 215
Lys Phe Glu Glu Leu Asn 230
Val Lys Gin Val乙eu Asp 245
Asp Val His Glu Val Val Leu Val Gly 260 265 Leu Leu Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys 280
Pro Asp Glu Ala Val Ala 295
Ser Gly Glu Glu Asp Thr 310
Leu Thr Leu Gly lie Glu
325 330 Lys Leu lie Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr
340 345 Phe Ser Thr Ala Ala Asp Asn Gin Pro Thr Val
355 360 Glu Gly Glu Arg Pro Met Thr Lys Asp Asn His
370 375 Asp Uu Thr Gly lie Pro Pro Ala Pro Arg Gly 385 390 395
Glu Val Glu 195
lie Glu lie
210 Thr Arg Ala 225
Leu Ser Pro
Val Gin Gin 275
Gly lie Asn
290 Gly Val lie 305
Val Asn Pro
Lys Lys His
Glu Lys Leu
Val Phe Asp Phe
1
Lys Thr
175 Arg Arg
160
190 Gin Thr
205
Phe Ser Glu
220 Leu Phe Arg
Leu Lys Arg lie
Thr Ser Lys
Lys Leu Thr
240
Asp 255 Pro Lys
Tyr Gly Ala
300
Gly Asp Leu Val 315
Thr Val Gly Gly
270
Glu Pro Ser Arg 285
Ala Val Gin Ala
Leu Leu Asp
320
Val Met Thr 335
Lys Lys Ser Gin lie 350
Thr lie Gin Val Phe 365
Leu Leu Gly Lys Phe 380
Val Pro Gin lie Glu
400Val Thr Phe Asp lie Asp Val Asn Gly lie Leu
405 410 Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys lie Thr
420 425 Asn Arg Leu Ser Pro Glu Asp lie Asp Arg Met
435 440 Lys Tyr Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu
450 455 Asn Glu Leu Glu Ala Leu Ala Tyr Ser 465 470 Ser Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser 485
Glu Glu Ala Val Glu Glu Lys lie Lys
500 505 Ala Ser Thr Asp Asp Phe Lys Gin Gin Lys Lys
515 520 Val Gin Pro lie lie Gly Lys Leu Tyr Lys Asn
530 535 Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Glu Glu Lys Asp 545 550
His Val Thr Ala Glu 415
lie Thr Asn Asp His 430
lie Asn Asp Ala Glu 445
Arg Val Asp Ala Lys
Leu Lys 475
Ala Asp Glu
490 Trp Uu Glu
Glu
Ala
460 Ser Gin
Lys Ser Leu
lie Ser Asn
Ala Gly Lys
Asp
480
Val 495 Ala Glu 510 Glu Asp lie 525
Gly Glu Gly Ala
540 Glu Leu
555
3权利要求
1、一种分离的多核苷酸分子，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列(A)与SEQ ID NO1所示序列或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同源的核苷酸序列；(B)与SEQ ID NO1所示序列或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列在中等严格杂交条件、优选高严格杂交条件下可发生杂交的核苷酸序列；(C)与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列；(D)编码如下氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO2所示序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO2所示序列有所不同的氨基酸序列；(E)SEQ ID NO1所示序列或SEQ ID NO1第208-1881位核苷酸所示序列；(F)(A)、(B)、(C)、(D)或(E)所述核苷酸序列的片段；和(G)与(A)、(B)、(C)、(D)、(E)或(F)所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2、 如权利要求1所述的多核苷酸分子，特征在于具有SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: l第208-1881位核苷酸所示核苷酸序列。
3、 一种分离的多肽，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸 序列(A) 与SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列至少70%、优选至少80%、 更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同源的氨基酸序列；(B) 由于一或多个(例如1-25个、l-20个，1-15个，1-10个，1-5个，l-3个)氨基酸残基的取代、缺失和/或插入而与SEQID N0:2所示序列有所不同的氨基酸序列；(C) SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列；(D) (A)或(B)或(C)所述氨基酸序列的免疫原性片段；和(E) 权利要求1或2的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
4、 权利要求3的分离的多肽，其包含SEQ IDN0:2所示氨基酸序列。
5、 一种核酸构建体或者重组表达载体，其包含权利要求1或2所 述多核苷酸分子。
6、 含有权利要求5的核酸构建体或者重组表达栽体的宿主细胞。
7、 一种生产多肽的方法，包括在能使所述多肽表达的条件下培养 权利要求6所述的宿主细胞和回收所表达的多肽。
8、 一种抗体，其能特异性结合权利要求3或4所述多肽。
9、 一种用于预防或治疗动物，尤其是牲畜和人的旋毛虫感染的药 物组合物，所述的药物組合物含有权利要求1或2所述多核苷酸分子 权利要求3或4所述多肽或者权利要求5的核酸构建体或者重组表达 载体。
10、 一种用于体外诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的 诊断试剂盒，其中含有权利要求1或2所述多核苷酸分子或者权利要 求3或4所述多肽或者权利要求8所述抗体。
11、 权利要求1或2所述多核苷酸分子或者权利要求3或4所述 多肽或者权利要求5的核酸构建体或者重组表达载体或者权利要求8 所述抗体在制备用于预防或治疗人畜旋毛虫感染的药物中的用途。
12、 一种寡核苷酸，其中含有SEQ IDN0: 1所示核苷酸序列或SEQ ID NO: l第208-1881位核苷酸所示序列或者其互补序列中的至少15 个、优选至少25个、更优选至少50个核苷酸或者其相似序列，所述 相似序列能够与SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO: 1第 208-1881位核苷酸所示序列或者其互补序列在高度严格杂交条件下发 生杂交。
13. 权利要求1或2所述多核苷酸分子或者权利要求3或4所述 多肽或者权利要求8所述抗体或者权利要求12的寡核苷酸在制备用于 诊断动物，尤其是牲畜和人的旋毛虫感染的诊断试剂中的用途。
14. 一种融合蛋白，其包含权利要求3或4所述多肽及另一融合对象。
15. 权利要求14的融合蛋白，其中所述融合对象是(3-半乳糖苷酶， 谷胱苷肽-S-转移酶或多组氨酸。
16. 权利要求1或2所述多核苷酸分子或者权利要求3或4所述 多肽或者权利要求5的核酸构建体或者重组表达载体用于刺激体外树 突状细胞分化成熟的用途，或者在制备用于刺激树突状细胞分化成熟的 药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及旋毛虫新抗原基因70KDa热休克蛋白基因，含有该基因的载体的构建及原核表达载体，以及所表达的蛋白。本发明还涉及所述基因及编码的蛋白及其应用。旋毛虫70KDa热休克蛋白基因重组蛋白免疫动物后产生高滴度的抗体并对攻击感染产生有效的免疫保护性。
文档编号C12N15/12GK101481691SQ20081013279
公开日2009年7月15日 申请日期2008年7月14日 优先权日2008年4月30日
发明者静 杨, 杨雅平, 王少华, 诸欣平, 冉 郝 申请人:首都医科大学