军团菌rRNA扩增用引物、检测方法及其检测试剂盒的制作方法

专利名称：军团菌rRNA扩增用引物、检测方法及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及军团菌rRNA扩增用引物组合、检测方法及其检测试剂盒。
背景技术：
军团菌是广泛分布在土壤、淡水等自然界环境中的革兰氏阴性杆菌。目前，约有50 种军团菌，所有菌种都有可能引起军团病。近几年，军团菌生长在冷却塔、循环温泉水、24小 时浴等人工环境中，吸入所产生的气溶胶而感染军团病的现象已成为一种问题。军团病进展快，需要尽早治疗。但是，青霉素类和头孢类抗生素等用于治疗其他细 菌感染的药物对军团病没有治疗效果，为了进行适当的治疗，需要在发病早期诊断出为军 团病。而且，从预防军团病的角度出发，有必要对人工环境中的军团菌进行快速检测。然而， 现有技术中检测军团菌的方法采用培养法，获得检测结果得需要5 7天的时间(非专利 文献1)。为了解决这个问题尝试了免疫学检测法、基因检测法。免疫学检测法使 用Legionella pneumophila (嗜肺军团菌)特异的抗体，因此能检测的Legionella pneumophila有限，且对其他菌种的灵敏度不足(非专利文献2)。另外，基因检测法中一般使用Jonas D.等的以军团菌16S核糖体DNA为标的的 PCR法，可以高灵敏地检测军团菌(非专利文献3)。另一方面，作为高灵敏地检测RNA的方法，可以举出利用RE-PCR法进行扩增并检 测其扩增产物量的方法，这种情况下，通常需要进行逆转录(RT)工程以及PCR工程两个阶 段的步骤。而这样的方法，使操作变得繁琐而成为恶化重复性的因素，并且，还增加二次感 染的危险性。进行这种RT工程以及PCR工程通常共需要2个小时以上的时间，这将对多个 检体的处理或检测成本的降低造成影响。—般采用有嵌入式荧光染料的环境下实施PCR工程并随着时间的经过测量荧光 增加的Kinetic RT-PCR法，通过这种方法至少可以用20分钟进行PCR工程以及测量工程， 但存在会检测出引物二聚体等非特异扩增产物的问题。并且，PCR法需要急剧升降反应温 度，这将对实现自动化的反应装置的省力化或低成本化造成妨碍。而且，在RT-PCR法中，由 于DNA也会被扩增，因此如上所述，将RNA作为对象时，需要通过DNase处理等来完全去除 试样中的DNA，而这个处理会造成操作的进一步复杂化。对此，作为在恒定温度条件下仅对RNA进行扩增的方法，有NASBA法(参照专利 文献1以及专利文献2)、TMA法(参照专利文献3)等。这种RNA扩增方法，对作为标的的 RNA通过包含启动子序列的引物、逆转录酶，以及需要时通过核糖核酸酶H(RNaseH)合成包 含启动子序列的双链DNA，并将该双链DNA作为模板用RNA聚合酶生产来源于标的RNA的包 含特定核酸序列的RNA，而这种RNA将接着进行成为包含连续启动子序列的双链DNA合成的 模板的连锁反应。接着，RNA扩增后，通过电泳法或者组合了可检测标记的核酸探针的杂交 法等，对扩增后RNA进行检测。这些RNA扩增方法适于在恒定温度条件下通过一阶段的步骤仅对RNA进行扩增，从而实现简便的RNA检测，然而，采用杂交法等的检测需要进行繁琐的操作，由于这样繁琐 的操作，不仅不适用于多个检体的处理或者自动化的实现，还存在重复性差或者容易造成 扩增核酸的二次污染等问题。对此，作为简便地进行RAN的扩增及检测的方法，可以举出Ishiguro等的方法 (参照专利文4以及非专利文献4)。该方法是，通过用嵌入式荧光染料做过标记的核酸探 针，即在形成标的核酸与互补双链时嵌入式荧光染料部分将会嵌入到互补双链部分而使荧 光特性发生改变的核酸探针，实施RNA扩增方法，并测量荧光特性变化的方法，因此，可以 在恒定温度下，通过一个阶段的步骤，且在密闭容器内，迅速简便地并同时进行RNA扩增以 及测量。专利文献1 日本公告专利第2650159号公报专利文献2 日本公告专利第315927号公报专利文献3 日本公告专利第3241717号公报专利文献4 日本公开专利申请特开2000-14400号公报非专利文献1 日本厚生省生活卫生局企划课监修新版军团病预防指引、财团法 人大厦管理教育中心发行非专利文献2 感染症学杂志Vo. 71，No. 7，p634_643非专利文献 3 :Jonas. D. et al, (1995) Journal of clinicalmicrobiology, 33, 1247-1252非专利文献 4 Jshiguro, Τ. et al, (2003) AnalyticalBiochemistry, 314, 77-86非专利文献5 :Steve. A. et al, (2006)Antimicrobial agents andchemotherapy, 50，1913-1920非专利文献6 :Naoki. S. et al, (2000)Biochemistry, 39,11270-1128
发明内容
目前已检测出约50种军团菌，作为不检测其他非军团菌的核酸扩增标的，希望 取得高度保存在军团菌菌种之间且具有与非军团菌明显不同的序列的标的核酸(标的基 因)。作为这样的标的核酸(标的基因)的候补，考虑过16S核糖体RNA，但实际上，即使 把16S核糖体RNA作为标的，军团菌菌种之间也有很多多样性，而且其中很多菌具有与非军 团菌高度相同性的序列。因此，取得能对约50种军团菌的16S核糖体RNA进行高效且同样 地扩增而并不对非军团菌的16S核糖体RNA进行扩增的引物组合的构造极其困难。鉴于以上问题，本发明的目的在于提供特异且高效地扩增军团菌的引物组合以及 利用该引物组合的军团菌核糖体RNA检测方法。本发明的发明人为了解决上述课题认真进行了一番研究，其结果研究出了能特异 地进行军团菌核糖体RNA扩增的引物组合以及采用该组合的检测方法。即，为了解决上述课题，本发明提供以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸扩增的 引物组合，该引物组合可进行军团菌核糖体RNA的扩增，且包括反义引物以及正义引物，其 中，反义引物包含与序列号表示为1或7的碱基序列的核酸在严格的条件下进行特异性杂 交的至少15个碱基以上的核苷酸；正义引物包含与序列号表示为47或49的碱基序列的核酸在严格的条件下进行特异性杂交的至少15个碱基以上的核苷酸。还有，为了解决上述课题，本发明提供以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸扩增 的引物组合，该引物组合可进行军团菌核糖体RNA的扩增，且包括反义引物以及正义引物， 其中，反义引物包含与序列号表示为45或48的部分碱基序列具有80%以上相同性的至少 15个碱基以上的核苷酸；正义引物包含与序列号表示为2或8的部分碱基序列具有80%以 上相同性的至少15个碱基以上的核苷酸。通过使用这些军团菌核糖体RNA的特异性引物组合进行各种核酸扩增法的构成， 可以特异且高效地扩增军团菌核糖体RNA，能够进行简便并可靠的军团菌的检测。还有，为了解决上述课题，本发明提供军团菌核糖体RNA的检测方法，该方法包 括以军团菌核糖体RNA为模板，并通过上述引物组合进行核酸扩增，获得扩增产物的工 程；以及，与上述工程一同进行或相继上述工程进行的用核酸探针检测上述扩增产物的工 程，上述核酸探针包含用可检测的信号生成单元做过标记的，且与序列号表示为6或11的 碱基序列或该碱基序列的互补序列中的任意一个具有80%以上相同性的至少15个碱基的 核苷酸。根据上述检测方法，通过组合进行军团菌核糖体RNA特异性引物组合的核酸扩增 法与利用军团菌核糖体RNA特异性标记核酸探针的检测，可以在密闭容器内同时且迅速、 简便地进行军团菌核糖体RNA的扩增以及检测。还有，为了解决上述课题，本发明提供军团菌核糖体RNA的检测试剂盒，该检测试 剂盒包括以军团菌核糖体RNA为模板进行核酸扩增，并用于获得扩增产物的所述的引物 组合；以及，用于检测上述扩增产物的核酸探针，该核酸探针包含用可检测的信号生成单元 做过标记的，且与序列号表示为6或11的碱基序列或该碱基序列的互补序列中的任意一个 具有80%以上相同性的至少15个碱基的核苷酸。根据上述检测试剂盒，可以组合进行军团菌核糖体RNA特异性引物组合的核酸扩 增法与利用军团菌核糖体RNA特异性标记核酸探针的检测，可以在密闭容器内同时且迅 速、简便地进行军团菌核糖体RNA的扩增以及检测。发明效果根据本发明，可以对军团菌核糖体RNA进行迅速、高灵敏的检测。并且，与现有技 术中的检测方法相比，本发明可以改善对活性菌的检测特异性。从而，根据本发明，可以减 少治疗后的患者、洗净后的水环境等中的错误信息。


图1 表示了实施例2中制成的嵌入式荧光染料标记核酸探针的结构，B1、B2、 B3、B4 表示碱基，按照 Ishiguro 等(Ishiguro，T. etal，(1996)Nucleic Acids Res. ,24, 4992-4997)的方法，在磷酸二酯的部分通过衔接物(linker)结合了嵌入式荧光染料(噁唑 黄)的探针，为了防止自3'末端-OH的延伸反应对3'末端-OH未进行乙醇酸(glycolic acid)的修饰。图2a 说明本发明的代表性碱基序列的图。图2b 说明本发明的代表性碱基序列的图。
具体实施例方式〔用语的说明〕本发明实施方式中的“军团菌”是指，广泛分布在土壤、淡水等自然界环境中的革 兰氏阴性杆菌。军团菌约分为50个种类，所有菌种都有可能引起军团病。本发明实施方式 中的军团菌，不仅包括提出本发明申请的当时记载于生物学分类(尤其是基因学分类或分 子生物学分类)中的细菌，还包括在过去分类为军团菌而现在被分为其他属中的军团菌类 边缘细菌(旧称军团菌)。作为军团菌类边缘细菌，例如有Fluoribacter或Tatlockia。这 些菌在医疗领域仍然是作为引发军团病的病因菌(军团菌)的重要细菌，根据本发明也能 将这些细菌作为对象进行检测，因此这些细菌也包含在“军团菌”的范畴内。另外，在本发明实施方式中“核糖体RNA”是指核糖体RNA(rRNA)的各亚单位。核 糖体RNA中存在沉降系数(S)不同的核糖体RNA的亚单位，本发明实施方式中的引物组合 主要以构成16S子单元的RNA为其标的。还有，本发明实施方式中的“核苷酸”或者“核酸”是指，由自然存在的碱基、糖以 及糖之间结合构成的核苷酸或者核苷(包含RNA以及DNA双方)，其低聚体(低聚核苷酸， 例如，2 100个碱基程度)以及聚合物(多核苷酸，例如，100个碱基以上)的总称。本发 明实施方式涉及的核苷酸或者核酸包括具有相同功能的不存在于自然界的单体、用荧光 分子等放射性同位体标记的单体、或者包含这些单体的低聚体或聚合体。另外，记载于序列表(序列号3、9、10、50)上的碱基符号y表示胞核嘧啶(c)或 胸腺嘧啶(t)。而且，本发明实施方式中的“引物”是指，在核酸扩增反应中，与模板进行杂交并为 了开始核酸扩增反应所必要的核苷酸。该引物，基于在核酸扩增反应中要进行扩增的模板， 可以与该模板进行杂交，并能进行核酸扩增反应，例如，能够生成特异性PCR法、LAMP法、 ICAN法、NASBA法、TMA法、3SR法、TRC法等中的生成物(在链长或序列中)，优选的，引物 本身包含所述模板的特异的序列。而且，一般的引物并不局限于此，通常还可以具有15碱 基 100碱基，优选的具有15碱基 35碱基的链长。引物的3'侧的区域最好对模板链具有互补性，但是，在5'侧也可以附加限制酶 识别序列或标记等功能性序列。还有，如后述说明，例如作为核酸扩增法采用ICAN法的情况下，引物不仅包括DNA 还包括RNA，或者根据需要也可以仅由RNA构成。针对适于本发明的引物，将在后面进行说 明。在PCR法或其他协同的核酸扩增反应中，一般使用由正义引物(第一引物)与反义引 物(第二引物)构成的一组引物，或者包含所述组以上引物的引物组合。在本发明实施方式中，“进行特异性杂交”是指，对于某核苷酸，其他的核苷酸通过 氢键进行互补性结合，而应该进行比较对照的核苷酸在同等条件下不进行结合的状态。但 也并不限定于此，即，没有必要对其他所有的核苷酸具有特异性，按照其使用目的具有特性 性即可。例如，在军团菌核糖体RNA的检测中，针对军团菌以外细菌的核糖体RNA的核苷酸 不进行结合的，可以说是“进行特异性杂交”。杂交条件可以根据其核苷酸的使用目的来选择。例如，针对用于PCR法中的引物 的核苷酸，可以选择在PCR法中的退火时的条件下进行杂交的条件。而且，使用为核酸探针 时，可以选择其杂交条件下进行杂交的条件。最好选择可在严格的杂交(hybridization)条件下进行杂交(hybridize)的条件。本发明实施方式中提及的“严格(stringent)的条件”是指，在杂交中具有甲 酰胺等改性剂的条件，例如，在温度42°C条件下使用50% (ν/ν)甲酰胺(formamide)与 0.1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin)/0. 1 % Ficoll/0. 1 %的聚乙烯吡咯烷酮 (Polyvinylpyrrolidone) /50mM的pH6. 5磷酸钠缓冲液、以及750mM的氯化钠、75mM柠檬 酸钠的条件，或者适当改变前述条件，当然并不限定于此。而且，杂交条件的温度可根据采 用的核酸扩增反应或者杂交(hybridize)反应而定，例如，可以是42°C、43°C、45°C、50°C、 55°C、60°C、65°C、68°C、70°C、72°C。而且，在本发明实施方式中，就“核酸扩增”方法来说，只要是能扩增作为标的的核 酸的公知的方法，都可以采用，作为利用引物以及引物组合的方法，例如可以举出PCR法、 LAMP法或其他核酸的协同核酸扩增方法。尤其是扩增RNA时，可以采用通过逆转录酶以RNA 为模板合成cDNA，并与此同时或相继于此，使用依据耐热性DNA聚合酶对来源于标的RNA的 核酸产物进行扩增的RT-PCR法(Kinetic RT-PCR法等)、RT-LAMP法或者其他核酸的协同 RNA扩增方法。并且，作为RNA扩增方法，即在恒定温度下仅扩增RNA的方法，除上述LAMP法之 外，还可以采用NASBA法(参照专利文献1以及专利文献2)、TMA法(参照专利文献3).这 种RNA扩增方法，简单地说，对作为标的的RNA通过包含启动子序列的引物、逆转录酶，以及 需要时通过核糖核酸酶H (RNaseH)合成包含启动子序列的双链DNA，并将该双链DNA作为模 板用RNA聚合酶生产来源于标的RNA的包含特定核酸序列的RNA，而这种RNA将接着进行作 为包含连续启动子(promoter)序列的双链DNA合成模板的连锁反应。并且，作为其他的核酸扩增方法，可以采用ICAN法(参照日本公告专利第3433929 号公报)。这种方法，简单地说，对作为标的的RNA通过逆转录酶并以RNA为模板合成cDNA， 与此同时或者相继于此，通过由RNA-DNA构成的嵌合引物(CHIMERIC PRIMER)、转录酶来合 成含RNA的双链DNA，通过在这种双链DNA中用核糖核酸酶H(RNaseH)形成刻痕来进行链置 换连锁反应，其中这里所说的链置换连锁反应是，生产包含来源于标的RNA的特定核酸序 列的DNA的反应。而且，在本发明实施方式中，作为扩增产物的检测方法，只要是检测核酸的公知的 方法，都可以采用。例如，可以对扩增后的核酸进行电泳检测，也可以采用杂交方法进行检 测，其中，这里所说的杂交方法是，使用结合了可检测标记的核酸探针的杂交方法。优选的， 可以采用如下所述的，有利于多检体处理、自动化、重复性或二次污染等特性的方法。当然，作为简捷地检测RNA的方法，并不局限于此，也可以使用以嵌入式荧光染料 做了标记的核酸探针(参照专利文献4以及非专利文献4中有关探针的部分)。这种使用探 针的检测方法，是在有核酸探针的情况下实施核酸扩增法，并测量荧光特性变化的的方法， 其中，这里所说的核酸探针是指，在形成标的核酸与互补双链时，嵌入式荧光染料部分嵌入 到互补双链部分而使荧光特性发生改变的核酸探针。通过此方法，可以在恒定温度下，通过 一个阶段的步骤且在密闭容器内迅速简便地同时进行RNA扩增以及检测(测量)。扩增核酸的检测方法，并不限定于上述方法，例如，在LAMP法中，可以以作为副产 物的焦磷酸镁(MagnesiumPyrophosphate)的白浊为指标进行检测，即使是不直接测量扩 增核酸的方法，但属于能适用于各种核酸扩增方法中的公知的扩增产物检测方法，均可以
8采用。并且，作为简便地进行RNA扩增及其检测的方法，还可以采用如专利文献4以 及非专利文献 4 中所记载的 TRC (Transcription Reverse-transcription Concerted reaction)法。TRC法是，组合了 TRC反应与 INAF (Intercalation ActivatingFluorescence probe)探针的，用于扩增RNA的实时检测方法，其中，TRC反应中逆转录反应与转录反应协 同进行，而且，INAF探针具有嵌入式荧光染料通过衔接物结合在低聚核苷酸链磷酸二酯的 磷原子上的结构。在TRC法中，例如在43°C的恒定温度下，逆转录酶与RNA聚合酶协同作用 形成逆转录反应与转录反应的循环，迅速完成指数函数性RNA的复制扩增。当INAF探针与 扩增RNA特异地互补结合时表示荧光增感，由此，从TRC反应的初期阶段起使其共存，可以 实时监控RNA的复制扩增。这些方法，可以按照添付在试剂盒中的说明书或者通常使用的规则(protocol) 来实施。而且，本发明实施方式中的“RNA聚合酶的启动子序列”是为了进行RNA聚合酶的 转录而所需的启动子序列，例如，在进行NASBA法、TMA法、3SR法等各种核酸扩增方法时，引 物需要具有RNA聚合酶的启动子序列。作为这样的RNA聚合酶的启动子序列，只要是能用 于各种核酸扩增方法中的可识别RNA聚合酶的启动子序列，任何启动子都能使用。作为RNA 聚合酶的启动子序列的具体例子，可以举出T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、或者T3RNA聚合 酶的启动子序列。优选的，将RNA聚合酶的启动子序列附加在其引物的5'末端上。而且，在本发明实施方式中，“用可检测的信号生成单元做标记”是指，利用常用于 生物学以及医学领域中的任意的信号生成单元进行标记的意思。作为由这样的可检测的信 号生成单元做的标记，例如，可以举出α -33P等放射性标记、利用荧光性嵌入剂等的荧光染 料标记、利用有色化合物等的染料标记、或者HRP或AP等酶标记，其中优选的是荧光染料标 记。而且，最好是通过形成互补性双链改变标记特性，更好的是，通过形成互补性双链来改 变荧光特性的嵌入式荧光染料标记。本领域的技术人员按照各种标记试剂/试剂盒的使用 方法或常用方法，可以很容易地做出这些标记。还有，在本发明的实施方式中，“相同性”是指，对齐序列，并在为了获得最大百分 率的序列同一性而按照需要导入了间隙的基础上，定义为与目标碱基相同的后补序列中的 核酸碱基数的百分率。此时，具有同一碱基(胸腺嘧啶与尿嘧啶可视为相同)的DNA与 RNA，两者的结合特性非常相似，从而定义为同一的核酸碱基。以决定相同性为目的的调 整(alignment)，可以通过本领域技术人员的技能范围内的各种方法得以实现，例如，使用 NCBI (National Center for Biotechnology Information)提供的 blast、blast2seq 或者 使用ALIGN等可以公开获得的计算机软件等，其中，在blast2seq中，可以使用根据标准的 初期参数来计算的值。另外，在用于核酸扩增的引物或其他探针等中，取代某碱基序列，可以使用与其碱 基序列具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或98%以上(100%以下)相同性的碱 基序列，或者，相对其碱基序列置换/削除/插入1碱基、2碱基、3碱基、4碱基、5碱基或者 多个碱基的碱基序列(与定义相同性时一样，具有同一碱基的RNA与DNA的置换，不包括在 这里所说的置换/削除/插入中)。还有，在本发明实施方式中的“充分互补的序列”是指，在核酸扩增反应条件(盐度、低聚核苷酸浓度等试剂组成以及温度)中，对军团菌核糖体RNA以及与其完全相同的核 酸可进行高效杂交的序列。还有，在本发明实施方式中的“充分互补的序列”是指，在核酸 扩增反应条件(盐度、低聚核苷酸浓度等试剂组成以及温度)中，对军团菌核糖体RNA以及 与其完全相同的核酸可进行高效杂交的序列。即，在本发明实施方式中，在核酸扩增反应中 对杂交效率不产生影响的范围内，“充分互补的序列”或者“充分相同的序列”没有必要分别 完全互补或完全相同。〔实施方式〕下面，对本发明的实施方式继续说明。本发明一实施方式提供的引物组合，以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸 扩增，该引物组合包括反义引物以及正义引物，其中，反义引物包含与序列号表示为 l(actgatacag gtgctgca)或 7 (ctacctggcc taatactgac act)的碱基序列的核酸在严格 的条件下进行特异性杂交的至少15碱基以上的核苷酸；正义引物包含与序列号表示为 47 (tataaccaac agctagttga catcgtttac agcgtgg) ^49 (cactgaaagt gctttacaac cct) ^tJ 碱基序列的核酸在严格的条件下进行特异性杂交的至少15碱基以上的核苷酸。该引物组 合可以对军团菌核糖体RNA进行扩增。还有，本发明另一实施方式提供的引物组合，以军团菌核糖体RNA为标的进行 核酸扩增，该引物组合包括反义引物以及正义引物，其中，反义引物包含与序列号表示为 45 (tgcagcacctgtatcagt)或 48 (agtgtcagta ttaggccagg tag)的部分碱基序列具有 80% 以上相同性的至少15个碱基以上的核苷酸；正义引物包含与序列号表示为2(CCaCgCtgta aacgatgtca actagctgtt ggttata) gJc 8 (agggttgtaa agcactttca gtg) ^ rP^MS^^II Jl 有80%以上相同性的至少15个碱基以上的核苷酸。该引物组合可以对军团菌核糖体RNA 进行扩增。根据上述实施方式提供的以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸扩增的引物组合， 其反义引物包含对序列号1充分互补的序列的至少15个核苷酸，且其正义引物包含对序 列号2充分互补的序列的至少15个核苷酸。根据上述实施方式提供的以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸扩增的引物组合， 其反义引物包含对序列号7充分互补的序列的至少15个核苷酸，且其正义引物包含对序 列号8充分互补性序列的至少15个核苷酸。S卩，包含在上述引物组合中的引物，具有与部分军团菌核糖体RNA序列相同或互 补的碱基序列，也就是说，以序列号1及47，或者，序列号7及49作为引物结合部位的物 质，优选的，例如，与序列号表示为1、47、7、49的碱基序列的核酸在严格条件下的进行特异 性杂交的物质，或者，与序列号表示为45、2、48、8的碱基序列的一部分具有80%以上相同 性的物质。通过使用上述引物组合进行核酸扩增，可以对军团菌进行迅速、高灵敏、特异的检 测。而且，与现有技术中的方法相比较，还可以提高针对活性菌的特意性。从而，根据本发 明可以减轻治疗后的患者或者洗净后的水环境中的假阳性。还有，使用上述引物组合并以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸扩增，可以将培 养法中需要5 7天的军团菌检查远远缩短为数十分 数小时。而且，在过去通常用于军团菌检测中的且根据Legionellapneumophila特异性抗体的免疫学方法中，可检测的物质不限于Legionella pneumophila，虽然对其他菌种的灵 敏度不够充分，但在使用引物组合的方法中，可以大范围地进行军团菌的检测。而且，在过去，在用于分子生物学方法中的且以军团菌RNA为标的的检测中，作为 标的的DNA在死菌中也能比较稳定地存在，因此，可能会造成治疗后的患者，清洗后的水环 境等中的假阳性。对此，在本发明中，通过把容易在死菌中分解的RNA作为标的，可以特异 性地检测活性菌(非专利文献5)。尤其是，与16S核糖体DNA相比，包含在1个菌中的量是 1000倍 10000倍，可以进行更敏感的检测。而且，即使是把16S核糖体RNA (DNA)作为标的的情况，实际上这种RNA (DNA)也在 军团菌种之间充满多样性，且具有不少与非军团菌具有高相同性的序列。因此，在本发明的 引物组合中，更优选的是，对约50种军团菌的16S核糖体RNA进行高效且相同的扩增，并具 有对非军团菌的16S核糖体RNA不进行扩增的特异性。在此，上述引物与序列号表示为45、2、48、8的碱基序列之间所具有的相同性在 85%以上、90%以上、95%以上或98% (100%以下)为佳。或者，对于上述碱基序列，也可 以使用包含了置换/削除/插入1碱基、2碱基、3碱基、4碱基、5碱基或者数个碱基的序列 的引物(与定义相同性时一样，具有同一碱基的RNA与DNA的置换，不包括在这里所说的置 换/削除/插入的范围内)。而且，更为优选的是，上述碱基序列内的连续的序列(或者其 置换体)。对于各个引物，按照其目的，可以追加包含其他各种物质，考虑到作为引物的有效 性，其长度至少是15碱基以上、或者18碱基以上、或者20碱基以上。对于长度的上限没有 特别的限制，考虑到引物过长所导致的核酸扩增反应的效率降低或者各扩增反应所需的引 物长度，所述上限可以是100碱基以下、80碱基以下、60碱基以下、或者50碱基以下。而且，作为以RNA为标的的核酸扩增的方法，可以举出RT-PCR法、RT-LAMP法、 NASBA法、TMA法、3SR法、ICAN法、TRC法等，而且任何方法都能使用本发明的引物组合。还有，本发明的又一个实施方式提供的引物组合，以军团菌核糖体RNA为标 的，并用于核酸扩增，该引物组合包括含序列号表示为3(tgyagyayyt gtatyagt)或者 9 (agtgtyagta ttaggyyaggtag)的碱基序列内的至少15碱基以上的核苷酸的反义引物， 以及上述的正义引物。该引物组合可以对军团菌核糖体RNA进行扩增。序列号3或9的 碱基序列，分别是序列号45或48序列内的，用胸腺嘧啶(thymine)置换了部分胞核嘧啶 (cytosine)的碱基序列。在上述实施方式中，对序列号1充分互补的序列的至少15核苷酸构成的上述反 义引物，特征在于由包含了用胸腺嘧啶置换胞核嘧啶的碱基的，序列号3所记载序列的至 少15核苷酸所构成。在上述实施方式中，对序列号7充分互补的序列的至少15核苷酸构成的上述反 义引物，特征在于由包含了用胸腺嘧啶置换胞核嘧啶的碱基的，序列号9所记载序列的至 少15核苷酸所构成。还有，本发明的又一个实施方式提供的引物组合，以军团菌核糖体RNA为标的， 并用于核酸扩增，该引物组合包括上述反义引物，以及含序列号表示为50(yyaygytgta aaygatgtyaaytagytgtt ggttata) 10 (agggttgtaa agyaytttya gtg) WMSii^1J WM 少15碱基以上的核苷酸的正义引物。该引物组合可以对军团菌核糖体RNA进行扩增。序列号50或10的碱基序列，分别是序列号2或8序列内的，用胸腺嘧啶置换了部分胞核嘧 啶的碱基序列。在上述实施方式中，对序列号2充分互补的序列的至少15核苷酸构成的上述正 义引物，特征在于由包含了用胸腺嘧啶置换胞核嘧啶的碱基的，序列号50所记载序列的 至少15核苷酸所构成。在上述实施方式中，由对序列号8充分互补的序列的至少15核苷酸所构成的上 述正义引物，特征在于由包含了用胸腺嘧啶置换胞核嘧啶的碱基的，序列号10所记载序 列的至少15核苷酸所构成。在核酸扩增中为了发挥高特异性，对于标的RNA与引物中至少一个不匹配的情 况，与全匹配的情况相比，效率显著降低的系列更有效。即，在本发明中，作为以提高针对军 团菌的特异性为目的的优选的实施方式，可以使用将引物中的至少一部分胞核嘧啶置换为 胸腺嘧啶的序列。另外，还揭示有标的RNA中的鸟嘌呤(G)与引物中的胸腺嘧啶(dT)形成比较稳定 的碱基对的记载(非专利文献6)。从而，在与原先标的RNA不存在失配的引物的情况(特 异性退化的情况)下，即使将序列中适当个数的胞核嘧啶置换为胸腺嘧啶也不会显著降低 杂交效率，但是，在至少有一个与标的RNA不匹配的情况(非特异性的退火)下，通过在这 些不匹配碱基的其他序列中导入从胞核嘧啶到胸腺嘧啶的置换，可以显著降低杂交效率。从而，如上述引物组合，通过使用将引物序列中的胞核嘧啶置换成胸腺嘧啶的引 物组合，能维持针对军团菌核糖体RNA的杂交效率，同时还能显著降低针对非军团菌核糖 体RNA的杂交效率。优选的，在本发明的实施方式中，反义引物是包含序列号4(tagCatCtgt atcagt) 的碱基序列的核苷酸。序列号4的碱基序列是，属于序列号3的碱基序列的尤其有效的序 列。可选的，在上述实施方式的引物组合中，序列号3记载的序列的至少15核苷酸所 构成的上述反义引物由序列号4记载的序列所构成。通过使用这些将特定序列作为引物序列而包含的引物组合，可以更可靠特异地进 行核酸扩增，并进行军团菌的检测。还有，在本发明实施方式的引物组合中，反义引物以及正义引物中的至少一个引 物是，附加RNA聚合酶的启动子序列、构成茎环结构的序列、或者发挥限定酶部位等特定功 能的序列所构成。通过使引物包含启动子序列，可以使用NASBA法、TMA法、3SR法等的核酸扩增方法。过去的PCR法需要急剧升降反应温度，这将对实现自动化的反应装置的省力化或 低成本化造成妨碍。对此，上述核酸扩增方法在恒温中连续进行扩增反应，其扩增效率高且 不需要特别的设备，即使模板是RNA也能与DNA —样通过一个步骤进行扩增，可用于诊断等 中，具有极其高的效果。在正义引物中追加启动子序列的情况下，需要在特性核酸序列的5’末端中切断标 的RNA。所谓特定核酸序列是指，与在标的RNA上的正义引物相同区域的5'末端起到反义 引物之间的互补区域的3'末端的碱基序列。作为切断标的RNA的方法，优选的可以采用如
12下方法，即，在特定核酸序列内的5'末端部分重复添加低聚核苷酸DNA(切断用低聚核苷 酸)，且该低聚核苷酸DNA具有对在5'方向上邻接的区域互补的序列，并根据核糖核酸酶 H(RNaseH)活性对作为添加结果形成的RNA/DNA混合的RNA部分进行切断。作为该切断用 低聚核苷酸，为了抑制始于其3'末端侧的延伸反应，优选使用3'末端羟基被进行化学修 饰的物质，例如被胺化的物质等。使用本发明的引物组合的核酸扩增是采用如下核酸扩增方法进行的，S卩，以军团 菌的核糖体RNA为模板，通过上述反义引物合成cDNA，并与此同时或相继于此，通过上述引 物组合与适当的DNA聚合酶活性及/或者RNA聚合酶的活性被连锁进行的核酸扩增方法。通过以上核酸扩增方法获得的扩增产物可以用公知的核酸检测方法进行检测，并 且，通过用可检测的信号生成单元做了标记的核酸探针也能进行特异的检测。还有，还可以将茎环结构或限定酶部位等的，发挥各种特定功能的序列附加包含 到引物中。对于这些发挥特定功能的序列，可以使用在基因学领域中采用的任意的功能序 列，尤其是，用于核酸的加工/扩增/检测的发挥特定功能的各种序列，这些序列可以通过 该领域惯用的方法来设计。还有，为了解决上述课题，本发明提供军团菌核糖体RNA的检测方法，该方法包 括以军团菌核糖体RNA为模板，并通过上述引物组合进行核酸扩增，获得扩增产物的 工程；以及，与上述工程同时进行或相继于上述工程进行的用核酸探针检测上述扩增产 物的工程，上述核酸探针包含用可检测的信号生成单元做过标记的，且与序列号表示为 6(cactgtatgt caagggtagg t)或 11 (acctacgcac cctttacg)的碱基序列或该碱基序列的互 补序列中的任意一个具有80%以上相同性的至少15个碱基的核苷酸。根据上述检测方法，通过采用了军团菌核糖体RNA特异性引物组合的核酸扩增法 与利用军团菌核糖体RNA特异性标记核酸探针进行的检测的组合，在无需要进行分离分析 的情况下，可以在恒定温度下，通过一个阶段的步骤，且在密闭容器内同时、迅速、简便地进 行军团菌核糖体RNA的扩增以及检测。而且，在上述军团菌核糖体RNA的检测方法中，进行核酸扩增而获得扩增产物的 工程包括(1)通过军团菌核糖体RNA的特定碱基序列的5'末端起到下游的至少一部分相 同的第一引物，以及上述特定碱基序列的3'末端起到上游的至少一部分互补的第二引物 (上述第一引物以及第二引物的至少一方在5'末端具有启动子序列)，生成具有启动子序 列以及位于该启动子序列下游的上述特定碱基序列的双链DNA的工程；(2)以上述双链DNA 为模板生成RNA转录产物的工程；(3)通过将上述RNA转录产物接着作为DNA合成的模板， 连锁地扩增上述RNA转录产物的工程。还有，为了解决上述课题，本发明提供军团菌核糖体RNA的检测试剂盒，该检测试 剂盒包括以军团菌核糖体RNA为模板进行核酸扩增，并用于获得扩增产物的上述引物组 合；以及，用于检测上述扩增产物的核酸探针，该核酸探针包含用可检测的信号生成单元做 过标记的，且与序列号表示为6或11的碱基序列或该碱基序列的互补序列中的任意一个具 有80%以上相同性的至少15个碱基的核苷酸。根据上述检测试剂盒，通过采用了军团菌核糖体RNA特异性引物组合的核酸扩增 法与利用军团菌核糖体RNA特异性标记核酸探针进行的检测的组合，可以在恒定温度下， 通过一个阶段的步骤，且在密闭容器内同时、迅速、简便地进行军团菌核糖体RNA的扩增以及检测。而且，上述检测试剂盒是用于实施上述检测方法的检测试剂盒，该检测试剂盒进 一步包括至少依赖于RNA的DNA聚合酶、核糖核酸酶H (RNase H)、依赖于DNA的DNA聚合酶 以及RNA聚合酶。在本发明实施方式中，用嵌入式荧光染料标记的低聚核苷酸序列可以采用与核酸 扩增产物中的至少一部分序列进行杂交而获得的物质，其中，优选采用序列号表示为6或 11的碱基序列或与该碱基序列的互补序列中的任意一个具有80%以上相同性的至少15个 碱基的核苷酸。更优选的，相同性是85%以上、90%以上、95%以上或者98% (100%以下) 为佳。或者，也可以是包含对于上述碱基序列，置换/削除/插入了 1碱基、2碱基、3碱基、 4碱基、5碱基或者多个碱基的碱基序列的核苷酸。更优选的是包含连续序列。而且，为了 抑制始于其3’末端侧的延伸反应，优选使用3’末端羟基被进行化学修饰的物质(例如附 加羟乙酸)。而且，作为核酸扩增方法，与过去一直使用的RT-PCR法相比，使用RT-LAMP法、 NASBA法、TMA法、3SR法会有更好的效果。使用RT-PCR法时需要进行逆转录(RT)工程以及 PCR工程的两阶段工程，这使操作变得繁琐，从而不仅恶化重现性还会增加二次污染的危险 性。而且，这些工程通常共需要2个小时以上的时间，因此对多检体处理或检测成本的降低 造成影响。一般采用在嵌入式荧光染料的存在环境下实施PCR工程并随着时间的经过测量 荧光增加的Kinetic RT-PCR法，通过这种方法至少可以用20分钟进行PCR工程以及测量 工程，但存在引物二聚体等非特异扩增产物也会被检测的问题。并且，PCR法需要急剧升降 反应温度，这将对实现自动化的反应装置的省力化或低成本化产生妨碍。而且，在RT-PCR 法中，由于DNA也会被扩增，因此如上所述，将RNA作为对象时，需要通过DNase处理等来完 全去除样品中的DNA，而这个处理会造成操作的进一步复杂化。针对这些问题，例如采用RT-LAMP法、NASBA法、TMA法、3SR法、ICAN法等方法时， 可以通过一个阶段的简便的工程在短时间内进行测量，从而有利于多检体处理或检测成本 的降低。并且，作为更优选的实施方式，采用TRC法(专利文献4以及非专利文献4)。通过 采用TRC法，可以在稳定温度下通过一个阶段且在密闭容器内迅速、简便地进行从扩增到 检测的工程。还有，在本发明的一实施方式中，军团菌核糖体RNA的检测方法包括以军团菌核 糖体RNA为标的，并根据由序列号4所记载的序列构成的反义引物以及依赖于RNA的DNA 聚合酶的活性合成cDNA的工程；根据RNaseH活性将分解/解离所生成的RNA/cDNA混合 物，且以cDNA为模板，并根据由序列号5所记载的序列构成的正义引物以及依赖于DNA的 DNA聚合酶生成双链DNA的工程，其中，这里所使用的由反义引物以及正义引物构成的引物 组合的一方在其5’末端具有RNA聚合酶的启动子序列，生成的双链DNA在其5’末端具有 功能性启动子；以及，以双链DNA为模板，用RNA聚合酶生产RNA转录产物的工程；在RNA转 录产物成为cDNA合成的模板且连锁反复进行各个工程的核酸扩增工程中，在使用嵌入式 染料做过标记的序列号6记载的序列或其互补序列所构成的核酸探针存在的条件下进行 核酸扩增，并通过测量反应也的荧光强度变化来检测军团菌核糖体RNA。
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还有，在本发明的一实施方式中，军团菌核糖体RNA的检测方法包括以军团菌核 糖体RNA为标的，并根据由序列号31(catcgtttac agcgtgg)所记载的序列构成的低聚核苷 酸DNA以及RNaseH活性，在军团菌核糖体RNA上的特定核酸序列的5’末端切断核糖体RNA 的工程；根据由序列号4所记载的序列构成的反义引物以及依赖于RNA的DNA聚合酶的活 性合成cDNA的工程；根据RNaseH活性将分解/解离所生成的RNA/cDNA混合物中的RNA部 分，且以cDNA为模板，并根据由其5’末端上附加有启动子序列的序列号5记载的序列所构 成的正义引物以及依赖于DNA的DNA聚合酶，生成双链DNA的工程；以该双链DNA为模板并 利用RNA聚合酶生产RNA转录产物的工程；在RNA转录产物成为cDNA合成的模板且连锁反 复地进行各个工程的核酸扩增工程中，在使用嵌入式染料做过标记的序列号6记载的序列 或其互补序列所构成的核酸探针存在的条件下进行核酸扩增，并通过测量反应液的荧光强 度变化来检测军团菌核糖体RNA。在以上实施方式中，对于发挥RNaseH活性、依赖于RNA的DNA聚合酶(逆转录酶) 活性、依赖于DNA的DNA聚合酶(转录酶)活性的酶没有特别的限定，但最好选用能保持所 述所有活性的逆转录酶为佳。逆转录酶，可以选用在分子生物学实验等中使用的公知的任 意的逆转录酶即可，尤其是，适于使用AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶等，以及 这些酶的衍生物。而且，对RNA聚合酶也没有特别的限定，可适用来源于噬菌体的T7RNA聚合酶、 SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶等，以及这些酶的衍生物。而且，在LAMP方法等中使用这些引物组合的情况下，引物组合可以是，在核糖体 RNA上进一步包括以这些序列之外为标的的引物的，4对引物构成的引物组合。如上所述， 根据各种核酸扩增方法的需要，可以进一步附加引物，附加的引物数量或序列等可根据各 种核酸扩增方法，按照常用手段来容易地进行设计。另外，上述实施方式所涉及的引物组合及其检测方法，并不限定本发明，只作为说 明本发明实施方式的例子。本发明的所保护的技术方案，并不局限于权利要求的叙述，本领 域技术人员在权利要求范围内进行的各种变更也属于本发明的保护范围。作为所述各种变更，例如有以下几种。基于本发明实施例，作为适用于正义引物 的碱基序列，代替上述实施方式中的序列号2的序列，可以使用序列号12(CCaCgCtgta aacgatgtca a)、13 (aaacgatgtc aattagctgt t)、14(aaacgatgtc aactagctgt t)、 15 (taaacgatgt caattagctg ttg)、16(tgtaaacgat gtcaattagc tgttg)、17(gctgtaaacg atgtcaatta gctgttg)、18(gtcaactagc tgttggttat a)、51 (caactagctg ttggttatat ga)、52(aaacgatgtc aactagctgt tggttatatga)、53(aaacgatgtc aactagctgt tggtta)、 54 (aaacgatgtc aactagctgttggttata)中的任意一种序列；作为适用于反义引物的碱 基序列，代替上述实施方式中的序列号45的序列，可以使用序列号19(CagCaCCtgt atcagt)、20(tagtatttgt attagt)、21(tagtatttgt atcagt)、22(tagtatctgt attagt)、 23 (tagtacctgt attagt)、24(tagcacttgt attagt)、25(cagtacttgt attagt)、 26 (tagtatctgt atcagt)、27(tagtacctgt atcagt)、28(tagcacttgt atcagt)、 29(cagtacttgt atcagt)中的任意一种序列.这种情况下，用于嵌入式荧光染料标记的荧 光探针的碱基序列，代替序列号6的序列，可以使用序列号44(CtgtatgtCa agggta)的 序列。而且，用于切断用低聚核苷酸的碱基序列，可以适当选用序列号30(CgtggaCtaC
15cagggtat)>31 (catcgtttac agcgtgg)>32(gtttacagcg tggacta)>33 (ttacagcgtg gactacc) >34(tacagcgtggactacca) >35(ttgacatcgt ttacagc)>55 (agctagttga catcgtttac ag)的任意一种。或者，作为适用于正义引物的碱基序列，代替上述实施方式所说明的序列号8的 序列，可以使用序列号36 (gttgtaaagcactttcagtg)或者 37 (gttgtaaagc attttcagtg) 的序列；，作为适用于反义引物的碱基序列，代替上述实施方式所说明的序列号48的序 歹Ij，"SJ M il! ffl 歹Ij 38 (gtattaggcc aggtag) >39 (agtattaggccaggta) >40 (agtattaggt taggta)>41(gtcagtatta ggccaggta)>42(agtgtcagta ttaggccagg ta) Φ ^{ M一^Ιψ 列。还有，用于切断用低聚核苷酸的碱基序列，还可以使用序列号43(acaaCCCtCaggCCtt) 的序列。以上所述变形例均包含在本发明所保护的技术范围内。实施例以下，对本发明的实施例进行具体说明，当然，下述实施例仅是举例说明，并不限 定本发明。另外，实施例中提及的市场上销售的药剂，没有特别说明以外均按照制造人的使 用说明进行使用。〔实施例1〕Legionella pneumophila 16S核糖体RNA以在SP6噬菌体RNA聚合酶/启动子 下游具有Legionella pneumophila 16S核糖体DNA(含碱基号1 1397的，碱基号按照 National CenterBiotechnology Information accession No. AF122885 M^ )白勺双Iil DNA 为模板进行体外转录，接着通过进行DNaseI处理将其双链DNA完全消化后精制并调制RNA。 对于该RNA，通过测量260nm中的吸光度来进行定量。在以下的实施例中，作为本发明的测 量对象的军团菌16S核糖体RNA的标准样品，使用了该RNA。〔实施例2〕按照如下步骤，制成了用嵌入式荧光染料进行标记的低聚核苷酸探针。首先，根据 Ishiguro 等的方法(Ishiguro, T. etal, (1996)Nucleic Acids Res.，24，4992-4997)，调制 了在序列号6所记载的序列的5'末端起第3个C与第4个T之间、在序列号11所记载 的序列的5'末端起第8个C与第9个A之间、在序列号44所记载的序列的5'末端起第 9个C与第10个A之间的磷酸二酯部分通过衔接物结合了恶唑黄的恶唑黄标记核酸探针 (图 1)。〔实施例3〕在本发明的方法中，使用各种组合的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记核 酸探针、切断用低聚核苷酸来进行军团菌16S核糖体RNA的测量。(1)用 RNA 稀释液(IOmM Tris/HCl (ρΗ8· 0)、ImM EDTA.O. 25U/μ 1 核糖核酸 / 抑制 剂(inhibitor)、5. OmMDTT)将在实施例 1 中调制的 Legionella pneumophila 16S 核糖体 RNA (含碱基号1 1397)稀释成IO6UO3UO2或者50copy/5 μ 1，并用作RNA样品。(2)将以下组成的反应液20 μ 1分注到0. 5ml容量的PCR用管(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes，perkinelmer 制)中，并在其中添加 5 μ 1 的上述 RNA 样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；
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18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mM ATP、CTP、UTP、GTP ；3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号记载于表1中)在序列号所记载的碱基序列的5'末端 上附加了 Τ7聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号记载于表1中)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号记载于表1中)在实施例2中调制 的物质；0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号记载于表1中)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 Τ7 RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量PCR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，反应液的荧光强度比超过1. 2时的判定为(+)，并将那 时的时间作为检测时间的结果表示在表1中。使用记载于表1中的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记核酸探针、切断用 低聚核苷酸的组合时，可在30分钟以内检测出ΙΟ6、103、IO2或者50cOpy/teSt的Legionella pneumophilal6S 核糖体 RNA。即使用，作为第一引物自序列号为5以及12 18中选择的序列、作为第二引物自 序列号为4以及19 29中选择的序列、作为嵌入式荧光染料标记核酸探针自序列号为6 以及44中选择的序列、作为切断用低聚核苷酸自序列号为30 35中选择的序列所构成的 组合；或者是，作为第一引物自序列号为8以及36以及37中选择的序列、作为第二引物自 序列号为38 42中选择的序列、作为嵌入式荧光染料标记核酸探针序列号为11的序列、 作为切断用低聚核苷酸序列号为43的序列所构成的组合，任何一种组合均能迅速检测出 Legionella pneumophila 16S t亥||体尺ΝΑ。其中，序列号为5以及12 18的序列分别是序列号为50的部分序列；序列号为 4以及19 29的序列分别是序列号为3的部分序列；序列号为8以及36以及37的序列 分别是序列号为10的部分序列；序列号为38 42的序列分别是序列号为9的部分序列。由此，通过使用由序列号为3的至少具有15核苷酸的第二引物以及序列号为50
17的至少具有15核苷酸的第一引物所构成的引物组合，以及由序列号为9的至少具有15核 苷酸的第二引物以及序列号为10的至少具有15核苷酸的第一引物所构成的引物组合，示 出了可以迅速，高灵敏地检测军团菌核糖体RNA的情况。如以上所述，根据使用本发明的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记核酸探 针的RNA扩增/测量方法，能够迅速地检测出Legionella pneumophila 16S核糖体RNA。[表1] [表 2] [表 3] [表4] 而且，对于表1之外的情形，也使用了上述表的低聚核苷酸组合，并以50、106、103、 102copy/test 的 Legionella pneumophilal6S 核糖体 RNA 为试样进行了 RNA 扩增 / 荧光测 量。判定荧光强度比超过1.2的物质为(+)，并将那时的时间作为检测时间。〔实施例4〕[实验体(军团菌)](1)用BCYEa琼脂培养基培养记载于表5中的军团菌7菌种7株。用已杀菌的棉 棒提取增殖的各菌体的菌落，并悬浮在TE缓冲液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH8. 0)中，稀 释到约100cfu/50 μ 1之后抽取RNA。(2)将以下组成的反应液20 μ 1分注到0. 5ml容量的PCR用管(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes，perkinelmer制)中，并在其中添加5 μ 1的上述抽取出的 RNA样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mM ATP、CTP、UTP、GTP ；3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号5)在序列号所记载的碱基序列的5'末端上附加了 Τ7 聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号记载于表5中)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号6)在实施例2中调制的物质；
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0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号31)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 I7RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量PCR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，在30分钟以内反应液的荧光强度比超过1. 2时的判定 为(+)，其结果表示在表5中。根据记载于表5中的引物组合可以对所有的军团菌7菌种7株进行检测。[表 5] 〔实施例5〕[特异性评价(CT置换的有效性)](1)用琼脂培养基培养记载于表1中的非军团菌9菌种9株(Bacillus cereus, Haemophilus influenzae, Stphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,Enterococcus faecalis, Pseudomonasaeruginosa, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus agalactiae以及Shigella boydii)。用已杀菌的棉棒提取增殖的各菌 体的菌落，并悬浮在TE缓冲液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH8. 0)中，稀释到约IO8 109cfu/50 μ 1 之后抽取 RNA。(2)将以下组成的反应液20 μ 1分注到0. 5ml容量的PCR用管(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes，perkinelmer制)中，并在其中添加5 μ 1的上述抽取出的 RNA样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mM ATP、CTP、UTP、GTP ；3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号5)在序列号所记载的碱基序列的5'末端上附加了 Τ7 聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号记载于表6中)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号6)在实施例2中调制的物质；0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号31)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 Τ7 RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量PCR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，在30分钟以内反应液的荧光强度比超过1. 2时的判定 为(+)，将其结果表示在表6中。[表 6]
21 在上表中的引物组合中，通过将胞核嘧啶置换为胸腺嘧啶，可以抑制非军团菌的 检测。而且，通过使用由作为第一引物的序列号为5的低聚核苷酸、作为第二引物的序列号 为4的低聚核苷酸所构成的引物组合，在维持对军团菌的灵敏度的同时，还能提高对非军 团菌的特异性。〔实施例6〕[活性菌特异性(添加氯的实验)](1)用BCYE α琼脂培养基培养Legionella pneumophila。用已杀菌的棉棒提取 增殖的各菌体的菌落，并悬浮在TE缓冲液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH8. 0)中，稀释到约 105cfu/50ylo在其中添加次氯酸而使氯浓度达到2mg/l，并进行自开始添加起所经过的时 间中活性菌数以及16S核糖体RNA的检测。利用BCYE α琼脂培养基培养活性菌，并确认活 性菌数。而且，为了检测16S核糖体RNA，抽取了 RNA。(2)将以下组成的反应液20 μ 1分注到0. 5ml容量的PCR用管(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes，perkinelmer制)中，并在其中添加5 μ 1的上述抽取出的 RNA样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mM ATP、CTP、UTP、GTP ；
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3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号5)在序列号所记载的碱基序列的5'末端上附加了 Τ7 聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号4)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号6)在实施例2中调制的物质；0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号31)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 T7RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量PCR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，反应液的荧光强度比超过1. 2时的判定为(+)，将其结 果表示在表7中。(5)作为比较，使用DNA扩增试剂盒(荣研化学公司制)检测了 16S核糖体DNA。 其结果表示在表7中。在16S核糖体RNA与16S核糖体DNA的检测中，比较了针对利用次 氯酸杀菌时的活性菌/死菌的特异性。当菌死亡时就不能检测16S核糖体RNA，但是在菌死亡43小时后仍能判定16S核 糖体DNA为阳性。根据以上结果，与将16S核糖体DNA为标的的情况相比，在将16S核糖体 RNA为标的的情况下能够检测出活性菌的特异性。[表 7] 〔实施例7〕在本发明的方法中，使用各种组合的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记核 酸探针、切断用低聚核苷酸来进行军团菌16S核糖体RNA的测量。(1)用 RNA 稀释液(IOmM Tris/HCl (ρΗ8· 0) UmM EDTA、0. 25U/μ 1 核糖核酸 / 抑制 剂、5. OmMDTT)将在实施例1中调制的Legionella pneumophila 16S核糖体RNA (含碱基号 1 1397)稀释成103copy/5 μ 1，并用作RNA样品。(2)将以下组成的反应液20 μ 1分注到0. 5容量PCR用管(Gene Amp Thin-Walled
23Reaction Tubes, perkinelmer制)中，并在其中添加5 μ 1的上述RNA样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mM ATP、CTP、UTP、GTP ；3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号记载于表8中)在序列号所记载的碱基序列的5'末端 上附加了 Τ7聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号记载于表8中)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号记载于表8中)在实施例2中调制 的物质；0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号记载于表8中)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 Τ7 RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量PCR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，反应液的荧光强度比超过1. 2的情况判定为(+)，并将 那时的时间作为检测时间的结果表示在表8中。使用记载于表8中的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记核酸探针、切断用 低聚核苷酸的组合时，可在30分钟以内检测出102copy/test的Legionella pneumophila 16S核糖体RNA。S卩，在使用由作为第一引物选自序列号为51 54中的序列、作为第二引物选自序 列号为4以及45中的序列、作为嵌入式荧光染料标记核酸探针的序列号为6的序列、作为 切断用低聚核苷酸选自序列号31以及55中的序列所构成的组合时，任何一种组合均能迅 速地检测 Legionella pneumophila 16S 核糖体 RNA。其中，序列号为51 54的序列分别是序列号为2的部分序列；序列号为4以及45 的序列分别是序列号为3的部分序列。由此，通过使用由序列号为3的至少具有15核苷酸的第二引物以及序列号为2的 至少具有15核苷酸的第一引物所构成的引物组合，示出了可以迅速，高灵敏地检测军团菌
24核糖体RNA的情况。如以上所述，根据使用了本发明的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记核酸 探针的RNA扩增/测量方法，能够迅速地检测出Legionella pneumophila 16S核糖体RNA。[表 8] 〔实施例8〕[检测灵敏度]在本发明的方法中，使用记载于表9中的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标 记核酸探针、切断用低聚核苷酸来测量了军团菌16S核糖体RNA的检测灵敏度。(1)用 RNA 稀释液(IOmM Tris/HCl (ρΗ8· 0) UmM EDTA、0. 25U/μ 1 核糖核酸 / 抑制 剂、5. OmMDTT)将在实施例1中调制的Legionella pneumophila 16S核糖体RNA (含碱基号 1 1397)稀释成IO3UO2,50或者30copy/5 μ 1，并用作RNA样品。(2)将以下组成的反应液20 μ 1分注到0. 5ml容量PCR用管(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes，perkinelmer 制)中，并在其中添加 5 μ 1 的上述 RNA 样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mM ATP、CTP、UTP、GTP ；3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号记载于表9中)在序列号所记载的碱基序列的5'末端 上附加了 Τ7聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号记载于表9中)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号记载于表9中)在实施例2中调制 的物质；0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号记载于表9中)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]
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2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 Τ7 RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量PCR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，在20分钟以内反应液的荧光强度比超过1. 2时的判定 为(+)，并将其结果表示在表9中。使用记载于表9中的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记核酸探针、切断用 低聚核苷酸的组合时，可在20分钟以内检测出103copy/test的Legionella pneumophila 16S核糖体RNA。并且，在由作为第一引物的序列号为51的序列、作为第二引物的序列号45 的序列、作为嵌入式荧光染料标记核酸探针的序列号6的序列、作为切断用低聚核 苷酸的序列号为55的序列所构成的组合中，20分钟以内检测出了 30cOpy/teSt的 Legionellapneumophila 16S 核Il体尺NA0如以上所述，根据使用了本发明的第一引物、第二引物、嵌入式荧光染料标记 核酸探针的RNA扩增/测量方法，在低copy数的情况下也能迅速地检测出Legionella pneumophila 16S 核糖体 RNA。[表 9] 〔实施例9〕[实验体(军团菌)](1)用BCYE α琼脂培养基培养记载于表10中的军团菌7菌种7株。用杀菌的棉 棒提取增殖的各菌体的菌落，并悬浮在TE缓冲液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH8. 0)中，稀 释到约100cfu/50 μ 1之后抽取RNA。(2)将以下组成的反应液20μ1分注到0.5ml容量的PCR用管(Gene AmpThin-Walled Reaction Tubes，perkinelmer制)中，并在其中添加5 μ 1的上述抽取出的 RNA样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mM ATP、CTP、UTP、GTP ；3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号51)在序列号所记载的碱基序列的5'末端上附加了 Τ7 聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号45)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号6)在实施例2中调制的物质；0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号55)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 Τ7 RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量P CR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，在30分钟以内反应液的荧光强度比超过1. 2时判定为 (+)，并将其结果表示在表10中。根据记载于表10中的引物组合可以对所有的军团菌7菌种7株进行检测。[表10]
27 〔实施例10〕[特异性评价](1)用琼脂培养基培养记载于表11中的非军团菌9菌种9株(Bacillus cereus、Haemophilus influenzae、Stphylococcusaureus> Streptococcus pneumoniae、 Enterococcus faecalis> Pseudomonas aeruginosa^ Streptococcus pyrogenes> Streptococcusagalactiae以及Shigella boydii)。用杀菌的棉棒提取增殖的各菌体的菌 落，将其悬浮在TE缓冲液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH8. 0)中，并稀释到约107cfu/50 μ 1 之后抽取RNA。(2)将以下组成的反应液20 μ 1分注到0. 5ml容量的PCR用管(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes，perkinelmer制)中，并在其中添加5 μ 1的上述抽取出的 RNA样品。[反应液的组成浓度是添加酶溶液后(30μ 1中)的最终浓度]60mM Tris/HCl (pH8. 6)；18mM 氯化镁；IOOmM 氯化钾；ImM DTT ；
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各0. 25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；各3mMATP、CTP、UTP、GTP ；3. 6mM ITP ；ΙμΜ第一引物(序列号51)在序列号所记载的碱基序列的5'末端上附加了 Τ7 聚合酶/启动子序列(序列号46)的物质；ΙμΜ第二引物(序列号45)；20ηΜ嵌入式荧光染料标记核酸探针(序列号6)在实施例2中调制的物质；0. 16 μ M切断用低聚核苷酸(序列号55)用氨基修饰3'末端-OH ；6U/30 μ 1核糖核酸/抑制剂(TaKaRa Bio公司制)；13% DMSO0(3)将上述反应液在温度43°C条件下保温5分钟后，按照如下组成，添加了 5μ 1 的事先在温度43°C条件下保温2分钟的酶溶液。[酶溶液的组成反应时(30μ 1中)的最终浓度]2%山梨糖醇；6. 4U/30 μ 1 AMV 逆转录酶(Life Science 公司制)；142U/30 μ 1 Τ7 RNA 聚合酶(Invitrogen 公司制)；3. 6μ g/30y 1牛血清白蛋白。(4)接着使用可直接测量PCR管且附有温调功能的荧光分光光度计，在温度43°C 条件下进行反应，与此同时，随着时间的经过测量反应溶液的荧光强度(激励波长470nm、 荧光波长520nm)。添加酶时为O分，在30分钟以内反应液的荧光强度比超过1. 2时的判定 为(+)，并将其结果表示在表11中。[表11]
29 在上述表所示的引物组合中，通过使用由作为第一引物的序列号为51的低聚核 苷酸、作为第二引物的序列号为45的低聚核苷酸所构成的引物组合，可以在维持对军团菌 的灵敏度的同时，还能提高对非军团菌的特异性。如以上所述实施例1 10的实验，通过使用本发明的引物以及引物组合等，对活 性菌具有高的检测特异性，并确认能够进行迅速，高灵敏的检测。工业上的可利用性本发明适用于需要进行军团菌检测的医学、药学、微生物学以及浴池的水质管理、 游泳池的水质管理、水环境的水质管理、建筑等冷却水的水质管理为首的公众卫生领域中。
权利要求
一种引物组合，以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸扩增，其特征在于进行军团菌核糖体RNA的扩增，该引物组合包括反义引物以及正义引物，其中，反义引物包含与序列号表示为1或7的碱基序列的核酸在严格的条件下进行特异性杂交的至少15个碱基以上的核苷酸；正义引物包含与序列号表示为47或49的碱基序列的核酸在严格的条件下进行特异性杂交的至少15个碱基以上的核苷酸。
2.一种引物组合，以军团菌核糖体RNA为标的进行核酸扩增，其特征在于进行军团菌 核糖体RNA的扩增，包括反义引物以及正义引物，其中，反义引物包含与序列号表示为45或 48的部分碱基序列具有80%以上相同性的至少15个碱基以上的核苷酸；正义引物包含与 序列号表示为2或8的部分碱基序列具有80%以上相同性的至少15个碱基以上的核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于上述反义引物包含序列号表示为3 或9的碱基序列内的至少15个碱基以上的核苷酸。
4.如权利要求3所述的引物组合，其特征在于上述反义引物包含序列号表示为4的 碱基序列的核苷酸。
5.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于上述正义引物包含序列号表示为 50或10的碱基序列内的至少15个碱基以上的核苷酸。
6.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于上述正义引物包含序列号表示为5 的碱基序列内的至少15个碱基以上的核苷酸。
7.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于上述反义引物以及上述正义引物 中的至少一个引物中，附加有RNA聚合酶的启动子序列、构成茎环结构的序列、或者发挥限 制酶部位等特定功能的序列。
8.一种军团菌核糖体RNA的检测方法，其特征在于包括以军团菌核糖体RNA为模板， 通过权利要求1或2所述的引物组合进行核酸扩增，获得扩增产物的工程；以及，与上述工 程一同进行或相继上述工程进行的用核酸探针检测上述扩增产物的工程，上述核酸探针包 含用可检测的信号生成单元做过标记的，且与序列号表示为6或11的碱基序列或该碱基序 列的互补序列中的任意一个具有80%以上相同性的至少15个碱基的核苷酸。
9.一种检测试剂盒，是军团菌核糖体RNA的检测试剂盒，其特征在于包括以军团菌核 糖体RNA为模板进行核酸扩增，并用于获得扩增产物的权利要求1或2所述的引物组合； 以及，用于检测上述扩增产物的核酸探针，该核酸探针包含用可检测的信号生成单元做过 标记的，且与序列号表示为6或11的碱基序列或该碱基序列的互补序列中的任意一个具有 80%以上相同性的至少15个碱基的核苷酸。
10.如权利要求8所述的军团菌核糖体RNA的检测方法，其特征在于进行核酸扩增而 获得扩增产物的工程包括(1)通过军团菌核糖体RNA的特定碱基序列的5'末端起到下游 的至少一部分相同的第一引物，以及上述特定碱基序列的3'末端起到上游的至少一部分 互补的第二引物(上述第一引物以及第二引物的至少一方在5'末端具有启动子序列)， 生成具有启动子序列以及位于该启动子序列下游的上述特定碱基序列的双链DNA的工程； (2)以上述双链DNA为模板生成RNA转录产物的工程；(3)通过将上述RNA转录产物接着作 为DNA合成的模板，连锁扩增上述RNA转录产物的工程。
11.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于用于实施权利要求10所述的检测 方法，该检测试剂盒进一步包括至少依赖于RNA的DNA聚合酶、核糖核酸酶H (RNase H)、依赖于DNA的DNA聚合酶以及RNA聚合酶。
全文摘要
迅速地、高灵敏地、特异地检测军团菌属细菌。本发明提供特异且高效地扩增军团菌核糖体RNA的引物组合以及依赖该引物组合的检测军团菌核糖体RNA的方法。
文档编号C12Q1/68GK101883852SQ20088011033
公开日2010年11月10日 申请日期2008年10月1日 优先权日2007年10月4日
发明者宇根藏人, 斋藤寿一, 林俊典, 桥本洋一, 泷泽文秀 申请人:东曹株式会社;株式会社Intec系统研究所