专利名称：从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及 规模化培养的方法。
背景技术：
间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。 间充质干细胞不仅具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力，还具有向多种 类型细胞分化的能力，可以分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等 多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，动物实验和初步的临床 研究已显示间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制的作用，所以间充质干细胞可作为理 想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、支持造血和促进干细 胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。然而就目前已比较成熟的骨 髓间充质干细胞而言，其含量非常低，仅占骨髓中单核细胞的1/105 106，并且采集骨髓给 患者带来极大的痛苦，取材不方便，所以这就迫切需要寻找一种取材简单且间充质干细胞 丰富的源组织。目前的研究表明脂肪组织中含有能分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的前 体细胞群，具有较强的增殖能力和多分化潜能，可称之为脂肪基质细胞或脂肪间充质干细 胞。与骨髓相比，脂肪组织可通过腹部的吸脂术获得，对患者损伤较小，获取相对容易，更重 要的是脂肪间充质干细胞不易受到肿瘤细胞污染，更容易进行体外净化，病人可以用自体 细胞，并且移植细胞更易被患者自身组织所接受，更快的整合到自身组织系统以发挥作用， 避免了一系列的伦理问题和异体细胞的免疫排斥等移植副反应。目前从脂肪中提取脂肪间充质干细胞一般步骤包括麻醉抽脂获取大量的人体脂 肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行扩增培养，其中所述 体外培养体系中含有胎牛血清；并且抽脂过程中需要大面积的局部麻醉，并在抽脂部位切 一个口，对病人造成了一定的创伤和痛苦，为了获得大量的脂肪组织，需要大面积的抽脂手 术，导致患者抽脂面积较大，手术时间较长，出血较多或导致发热现象，如果后期护理不好 容易引发炎症。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种减少病人痛苦、满足临床安全应用 的从微量热脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法。本发明是通过如下技术方案实现的—种从微量人脂肪组织提取间充质干细胞的方法，主要包括如下步骤(1)微创抽脂，注射利多卡因小面积的局部麻醉，利用微型吸引针无菌抽取患者微 量脂肪组织；(2)脂肪间充质干细胞的提取，采用磷酸盐缓冲液浸泡、离心洗涤无菌获取的脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行培养。步骤(1)中，抽取的脂肪组织为5ml。步骤(2)中，采用磷酸盐缓冲液浸泡，1500r/min离心洗涤脂肪至，用0. I型胶 原酶37°C水浴消化约30min，加磷酸缓冲液稀释胶原酶并离心，悬浮下层沉淀，100目滤网 过滤，1500r/m离心lOmin，以去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，随后进行体外培养。本发明间充质干细胞规模化培养的方法，主要包括如下步骤(1)原代培养，培养体系为STEMPRO MSC SFM无血清培养基，含有2mM/ml的谷氨酰 胺和100U/ml的青-链霉素；(2)细胞鉴定，流式检测细胞表面抗原⑶44和⑶34的表达，体外分化实验检测脂 肪间充质干细胞多向分化潜能，包括像脂肪细胞的分化和成骨细胞的分化；(3)规模化扩增，采用STEMPRO MSC SFM无血清培养体系，含有2mM/ml的谷氨酰 胺、lOng/ml的血小板衍生生长因子、lOng/ml的碱性成纤维细胞生长因子和0. 5 μ g/ml的 庆大霉素。本发明有效减少了病人的痛苦，排除了非常瘦的患者无法获取脂肪组织的障碍， 整个细胞培养体系中尽量避免了使用动物源制品，特别是没有血清制品，满足了将来临床 安全应用的需求。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。图1为倒置相差显微镜下脂肪间充质干细胞的形态图；图2为流式检测人脂肪间充质干细胞表面标志的表达示意图；图3为培养的第三代细胞成脂和成骨诱导分化染色检测图。
具体实施例方式实施例1.试剂STEMPRO MSC SFM无血清培养基、青-链霉素，庆大霉素、谷氨酰胺、血小板衍生生 长因子、碱性成纤维细胞生长因子、I型胶原酶、胰酶、磷酸盐缓冲液、油红O、茜素红。2.脂肪间充质干细胞的分离提取采用磷酸盐缓冲液浸泡、1500r/min离心洗涤脂肪组织，用0. 1 % I型胶原酶37°C 水浴消化约30min，加磷酸缓液稀释胶原酶并离心，悬浮下层沉淀，100目筛网过滤，1500r/ m离心lOmin，以去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，加入无血清培养液，吹打均勻， lOOOr/m离心5min;弃上清液，加入完全培养基A，吹打均勻，台盼蓝染色，用计数板计数后， 按IXlO5AiL的密度将细胞接种于培养瓶中，在37°C、5% CO2、饱和湿度条件下培养。24 48小时弃去未贴壁的细胞，并补充相同的培养液。以后每2 3d半换液，记 为PO代；待细胞达到80 90%汇合时，胰蛋白酶消化，按1 3比例传代，并标记为P1。3、脂肪间充质干细胞的鉴定(1)脂肪间充质干细胞的形态特征倒置相差显微镜下观察培养的细胞呈梭形的 成纤维细胞样，局部呈漩涡状(如图1所示)。
(2)人脂肪间充质干细胞的表型检测用直接免疫荧光法检测以上得到的梭形细 胞的表面标志的表达，细胞用藻红蛋白(PE)CD44和异硫氰酸荧光素(FITC)CD34标记后进 行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan (Becton Dickinson)。结果表明这种梭形细胞表达 间充质干细胞的表面标志CD44，不表达造血干细胞的表面标志CD34(如图2所示)。(3)人脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化及油红0染色检测细胞传至第3代时将其以2X107L的细胞数转入成脂诱导培养基中进行培养。诱 导培养后不同时间段，对成脂诱导组进行油红0脂肪颗粒染色。成脂诱导培养基包含基 础培养基DMEM，10%胎牛血清、0. 5mM IBMX(isobulyl-l-methylxanthione)、0. ImM消炎痛、 IuM地塞米松。在第6天、第12天和第16天分别进行油红0染色。结果显示培养12天 可见到折光度增加的液泡充满整个细胞；油红0染色发现培养中约60 80%细胞富含脂 肪滴(如图3A所示)。说明干细胞亚群可在体外诱导分化成脂肪细胞。(4)人脂肪间充质干细胞向骨细胞分化及茜素红染色检测取第三代人间充质干细胞，培养在6孔板中，待细胞长到80%左右时换用成骨诱 导液培养，诱导液的成分包含基础培养基DMEM，10%胎牛血清、ΙΟΜπιβ-磷酸甘油、0. ImM 抗坏血酸磷酸盐Vc、0. IuM地塞米松。每三天换液，培养3周，于2周、3周分别进行茜素红 染色观察。结果显示成骨诱导培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长 密度的增长形成多层的结节结构，而对照组中细胞仍是梭形且呈单层生长；2周之后已有 矿化结节形成了，3周后结节比较多，染色比较明显(如图3B所示)。说明干细胞亚群可在 体外诱导分化为成骨细胞。4.人脂肪间充质干细胞的规模化扩增培养的原代(P0代)细胞达到80 90 %汇合时，胰蛋白酶消化，按1 3比例 传代，采用无血清培养体系B (STEMPRO MSC SFM无血清培养基，含有2mM/ml的谷氨酰胺、 10ng/ml的血小板衍生生长因子、lOng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0. 5 μ g/ml庆大霉 素)进行扩增，其扩增速度比用培养体系A快，细胞达到90%汇合，按1 3传代，一般细胞 2 3天传代一次；而培养体系A中的细胞按同样比例传代，细胞一般3 4天传代一次。 3周就可得到IO9个细胞，细胞状态良好。
权利要求
一种从微量人脂肪组织提取间充质干细胞的方法，其特征为，主要包括如下步骤(1)微创抽脂，注射利多卡因小面积的局部麻醉，利用微型吸引针无菌抽取患者微量脂肪组织；(2)脂肪间充质干细胞的提取，采用磷酸盐缓冲液浸泡、离心洗涤无菌获取的脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行培养。
2.根据权利要求1所述的从微量人脂肪组织提取间充质干细胞的方法，其特征在于 步骤(1)中，抽取的脂肪组织为5ml。
3.根据权利要求1或2所述的从微量人脂肪组织提取间充质干细胞的方法，其特征在 于步骤(2)中，采用磷酸盐缓冲液浸泡，1500r/min离心洗涤脂肪至，用0. 1% I型胶原酶 37°C水浴消化约30min，加磷酸缓冲液稀释胶原酶并离心，悬浮下层沉淀，100目滤网过滤， 1500r/m离心lOmin，以去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，随后进行体外培养。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞规模化培养的方法，其特征为，主要包括如下 步骤(1)原代培养，培养体系为STEMPRO MSCSFM无血清培养基，含有2mM/ml的谷氨酰胺和 100U/ml的青-链霉素；(2)细胞鉴定，流式检测细胞表面抗原⑶44和⑶34的表达，体外分 化实验检测脂肪间充质干细胞多向分化潜能，包括像脂肪细胞的分化和成骨细胞的分化; (3)规模化扩增，采用STEMPRO MSC SFM无血清培养体系，含有2mM/ml的谷氨酰胺、lOng/ml 的血小板衍生生长因子、lOng/ml的碱性成纤维细胞生长因子和0. 5μ g/ml的庆大霉素。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，特别公开了一种从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法。该从微量人脂肪组织提取间充质干细胞的方法，通过注射利多卡因小面积的局部麻醉，利用微型吸引针无菌抽取患者微量脂肪组织；然后采用磷酸盐缓冲液浸泡、离心洗涤无菌获取的脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行培养得到。本发明有效减少了病人的痛苦，排除了非常瘦的患者无法获取脂肪组织的障碍，整个细胞培养体系中尽量避免了使用动物源制品，特别是没有血清制品，满足了将来临床安全应用的需求。
文档编号C12N5/0775GK101974486SQ201010558399
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者孙涛, 李荣荣, 王泰华 申请人:王泰华