专利名称：用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1(sdf-1)的方法
技术领域：
本发明涉及一种用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)的方法。
背景技术：
1、SDF-I蛋白的生物学作用与应用前景基质细胞衍生因子-I(SDF-I)又称为CXCL12，是一种小分子的细胞因子(约70氨 基酸)，属于趋化因子蛋白家族。其可以高效、高灵敏度地检测SDF-I靶蛋白的特异性生物 指标，用于肿瘤，炎症和其他的恶性病变临床诊断。SDF-I在造血、发育、肿瘤的发生与迁移、介导炎症和免疫反应等很多方面具有重 要的生物学功能。SDF-I与其受体CXCR4在胚胎发育的过程对于胚胎的存活至关重要；在 骨髓造血功能的形成，淋巴细胞生成及心室间隔的形成等过程也发挥着重要作用。SDF-I自 身可以作为药物用于与发育缺陷相关疾病的治疗。另外，SDF-I是一种高效的淋巴细胞、核细胞及树突状细胞的趋化因子，能介导T 淋巴细胞紧密粘附并过内皮细胞，发生免疫反应。SDF-I还具有抗炎效应，可以逆转抗原诱 导的T细胞向炎症部位的趋化运动。类风湿关节炎滑膜高水平表达SDF-1，在滑膜内表达 CXCR4的记忆T细胞大量聚集。SDF-I能刺激滑膜迁移，并且抑制激活诱导的T细胞凋亡， 作为一个重要的调节因子发挥抗炎作用。SDF-I蛋白产品作为免疫调节和抗炎类药物是另 一有广阔前景的领域。默克、辉瑞等多家大型跨国药物公司已展开以SDF-I蛋白作为药物 分子的技术和产品开发。SDF-I在某些原位肿瘤如宫颈癌病人体内表达明显升高，SDF-I可作为一种特异 性的分子标记能够用于早期的诊断；在对肿瘤迁移的很多研究中发现，某些肿瘤如前列腺 癌或乳腺癌，SDF-I在某器官的高浓度表达代表了肿瘤细胞首先转移的目的地。存在多部 位浸润的血液肿瘤患者，其血清中SDF-I的浓度明显高于未出现浸润患者。因此，将SDF-I 作为肿瘤治疗上的新靶点，阻断SDF-I的产生或其与CXCR4的相互作用，可能有助于阻断肿 瘤细胞向周围组织的扩散转移。Millipore和R&D system等研究机构和生物技术公司已在 大力研发以SDF-I作为诊断指标用于早期疾病诊断的配套产品。除此之外，SDF-I还与许多疾病，如HIV感染、心肌梗死、移植肾排异、急性缺血性 肾损伤等密切相关。以SDF-1/CXCR4为靶分子的研究将可能为许多疾病的早期诊断和治疗 提供新的方向，在药物研究及临床检验中具有极大的市场潜力。2、SDF-I蛋白生产的现状目前全球市场上的SDF-I均采用原核细胞融合表达技术以及变性和复性的传统 工艺生产获得，产品纯度低，生物活性难以达到基础研究需要，对于临床诊断和治疗的目的 更是无法满足。临床用蛋白类药物和疫苗等多采用哺乳动物细胞表达。与原核细胞相比，哺乳动物细胞表达系统具有许多优势。首先，内毒素的含量大大降低，减少了潜在的生物危害和 风险；其次，哺乳动物细胞具有成熟的蛋白翻译后加工体系，合成的重组蛋白经过糖基化等 翻译后加工生物学活性与天然蛋白相似；再次，哺乳动物细胞蛋白表达量高，适合大规模生 产；最后，哺乳动物细胞表达的蛋白纯度很高，易于进行后续的纯化加工过程。因此，用哺乳 动物细胞生产SDF-I是生产人用重组SDF-I蛋白的必然趋势，对于推动临床诊断环节的新 型生物技术发展和临床药物开发无疑具有重要意义。国际上很多公司和实验室进行大规模的蛋白表达多采用瞬时转染的方法进行，将 连接目的基因的表达载体导入哺乳动物细胞利用其蛋白表达体系获得大量的目的产物。这 样的瞬时表达存在以下缺点每次转染都需制备大量的高纯度质粒，消耗大量的人力、物力 和财力；瞬时转染的蛋白只能获得一过性表达，收到的蛋白量受到限制；每次获得的蛋白 量不太稳定。通过筛选稳定表达的细胞系可以很好地解决以上问题。获得稳定表达的细胞 株稳定、高效、一劳永逸地生产所需蛋白，对于降低成本、简化实验流程、优化生产工艺和提 高生产效率具有重要的意义。发明目的本发明旨在建立能稳定生产具有生物学活性的SDF-I蛋白的哺乳动物细胞株的 方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。本发明提供一种用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)的 方法，该方法通过如下步骤用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1 (SDF-I)(1)制备转染用质粒和PEI ；(2)质粒转染CHO细胞；(3)稳定表达细胞系的建立；(4)单克隆细胞株的建立及蛋白分泌；(5)分泌SDF-I蛋白的纯化。所述的SDF-I是通过能稳定生产的哺乳动物细胞中制备纯化的。
所述的SDF-I的表达为分泌性的可溶性蛋白。所述的纯化所得SDF-I作为生物制剂应用于研究和临床诊断。本发明包括制备转染用质粒和PEI、质粒转染CHO细胞、稳定表达细胞系的建立和 单克隆细胞株的建立等五个步骤。用PEI作为转染试剂，其作为“质子海绵”可以高效地结 合双链DNA，把其带入目的细胞中。在kocin的筛选压力存在下，部分DNA可以进入细胞核 内，并整合入基因组，随着细胞的分裂而复制，从而稳定地存在于细胞中，使目的蛋白得到 持续的表达。本发明所用的CHO细胞是工业生产人临床用蛋白最为常见的一种细胞。不仅表达 水平高，蛋白翻译后加工方式如糖基化等与体内天然蛋白相似，而且无潜在的生物危害性， 自身分泌的蛋白很少从而简化了后续的纯化过程，特别适于分泌型细胞因子或趋化因子等 产物的大规模生产。而且这种细胞可以通过驯化在无血清培养基中生产，对于降低工业生 产的成本是必需的。细胞密度能够提高数十倍甚至数千倍，大大提高了蛋白产量。本发明通过稳定细胞库的单克隆化，经过筛选挑取表达水平最高的几株细胞进行 留种和规模化进一步提高了蛋白产量。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的SDF-I蛋白。本项技术应用于SDF-I蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，
提高产品产量和质量。
具体实施例方式实施例1、转染用质粒的制备用去除内毒素的质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)制备转染所需连有SDF-I 基因的表达质粒。方法见说明书。用200μ1 TE缓冲液溶解质粒，紫外分光光度计测其浓度。2、转染用PEI的制备1)在500ml的烧杯中倒入450ml Milli-Q制备的超纯水；2)天平称量500mg线性PEI (购自Poly Science公司)，加入烧杯中，磁力搅拌器 不断搅动；3)逐滴加入预先配好的12M浓HCl使其pH < 2. 0 (大约需要800 μ 1)；搅动PEI 溶液约2-3小时；4)加入预先配制的IOM NaOH溶液将pH调至7. 0 (大约需要500 μ 1)；用Milli-Q 超纯水将PEI溶液定容至500ml ；5)0. 22-μ m滤膜过滤PEI溶液，分装成Iml/管，_20°C保存。3、质粒转染CHO细胞1)转染前一天(约M小时)，将CHO细胞用无抗、含10%胎牛血清的FlI完全培 养基重悬，按照1 X 105/ml铺入6孔板中，每孔加入1. 8ml，将6孔板放置在预先放在培养箱 中、洁净的湿盒里，5% C02培养箱中培养过夜；2)转染当天，将所需的磷酸盐缓冲液预热到25° -37°C ；冰上溶解连接SDF-I基 因的表达质粒和PEI ；3)在1. 5mL的Ep管中加入200 μ L PBS,加入2 μ g质粒DNA，在振荡器上轻轻涡 旋；4)加入4μ L lmg/mL的PEI，立即在振荡器上振荡3次，每次3秒钟室温下将混 合液孵育15分钟； 5)取出预先铺入6孔板的细胞，将DNA/PEI混合液加入细胞培养液中，前后轻轻晃 6孔板混勻将细胞放入培养箱中继续培养。4、稳定表达细胞系的建立1)CH0细胞转染M小时-48小时后，将细胞用0. 25%胰酶消化处理后计数，按照 1 X IOVmL重新铺入6孔板中，每孔2mL。同时按照300 μ g/mL的浓度加入筛选用抗生素 Zeocin ；2)每隔4-5天进行细胞换液，并重新加入300 μ g/mL Zeocin ；大约筛选3周获得 稳定表达SDF-I蛋白的细胞株。5、表达SDF-I的单克隆细胞株的建立1)将筛选了 3周的转染SDF-I基因的CHO细胞进行严格的细胞计数，按照0.3个 /孔的细胞密度铺入96孔板，继续用300 μ g/mL Zeocin维持筛选；
2)细胞铺入1小时后开始观察铺入的细胞情况，标记仅有一个细胞的孔，并在第3 天，第5天后观察各孔细胞生长情况，大约每个96孔板中能够长出10-20个单克隆来源的 细胞；3)1星期后将长出了单克降的孔中细胞分别消化吹下，500 μ L FlI完全培养基 (300 μ g/mL Zeocin)重悬，铺入 6 孔板；4)细胞在6孔板中4-5天后，将其消化后，重新再铺入60mm培养皿中扩大培养。 克隆放大后取出一部分细胞冻存，另一部分用于检测。
权利要求
1.一种用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)的方法，其特征在 于该方法通过如下步骤用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1 (SDF-I)(1)制备转染用质粒和PEI；(2)质粒转染CHO细胞；(3)稳定表达细胞系的建立；(4)单克隆细胞株的建立及蛋白分泌；(5)分泌SDF-I蛋白的纯化。
2.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)的 方法，特征在于所述的SDF-I是通过能稳定生产的哺乳动物细胞中制备纯化的。
3.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)的 方法，特征在于所述的SDF-I的表达为分泌性的可溶性蛋白。
4.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-I(SDF-I)的 方法，特征在于所述的纯化所得SDF-I作为生物制剂应用于研究和临床诊断。
全文摘要
本发明涉及一种用哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的方法。本发明旨在建立能稳定生产具有生物学活性的SDF-1蛋白的哺乳动物细胞株的方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的SDF-1蛋白。本方法应用于SDF-1蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。
文档编号C12N15/85GK102080073SQ20101055879
公开日2011年6月1日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者周慧芳, 朱月珍, 杨宣武, 柴笑梅 申请人:江苏普罗赛生物技术有限公司